The physical forces to which living cells are most commonly exposed are fluid shear, pressure, and stretch. These mechanical stimulations influence the physiological and pathological condition of the organism, which induces many aspects of human health and disease. This study presents a new kind of microfluidic biomechanical device using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) membrane deflection for stimulation and deformation of cell. To understand the biomechanical effects of cell deformation, mechanical stress is applied to cells with the deflection of the PDMS membrane between two microchannels, formed by multilayer soft lithography. The membrane functions as an on-off valve for closing the fluid channel and a loading membrane for applying a mechanical stress; the deflected membrane presses cells either directly or hydrostatically. As a demonstration of the feasibility of this microfluidic device, various applications are examined, including cell deformation under compression, reversible cell deformation, and cell viability assay. In addition, cell lysis was achieved by the compressive force through the deflection of membrane.
As has been noted earlier, cellular mechanical properties related to the cell deformation are important for the understanding of the biomechanical effects with respect to cell. However, it is difficult to obtain the same viscoelastic parameters even for the same cell type under similar condition. The reasons why the measurement of the viscoelastic parameter is difficult are as follows: The theoretical model is overly simplified; Cells are characterized by complexity including inhomogeneity, anisotropy, no solidity, viscosity, and living organism. Therefore, the main focus is to develop a new and convenient biomechanical tool, capable of studying the integrity of cancer cells under excessive deformation; in particular, in comparison with those of normal cells. Here, it is well known that the amount of F-actin in cancer cells is fewer than that of normal cells and bulges occur at the sites where the cytoskeleton becomes detached from the membrane bilayer. Accordingly, I have supposed that cell having cytoskeleton beneath the plasma membrane corresponds to the rubber ball wound with thread. When the rubber ball wound with thread is compressed, bulges will be appeared between the thread. Naturally, the rubber ball wound with lots of threads will have more bulges than that with some threads. To examine the possibility of this approach, I have demonstrated the difference of the bulge generation of normal (MCF10A) and cancerous (MCF7) cell. Thus, the morphology of bulge generated and the peripheral strains at the moment of bulge generation were showed and identified as a physical indicator for variation of cytoskeleton in transformed cells. After excessive deformation, MCF7 cells had irregularly-generated bulges which are not evenly distributed on the cell periphery. Contrary to this, MCF10A cells had orderly-generated bulges. In addition, the morphologies of bulges of MCF7 and MCF10A cell looked swollen protrusion and tubular protrusion, respectively. Peripheral strains at the moment of bulge generation were also 72% in MCF7 and 46% in MCF10A. This results support the above-mentioned assumptions. As a result, this study was the first demonstration correlating the bulge generation with the cytoskeleton quantity inside the cells in that a visible change of the external feature reflects internal alteration such as cytoskeleton transformation. This technique will be useful in studying the characteristics of cells including the deformability and rigidity, the robustness of cellular membrane, and mechanotransduction such as stretch-activated ion channels.
본 연구에서는 세포를 자극하고 변형시키기 위해 PDMS 멤브레인의 휘어짐(deflection)을 이용하는 새로운 종류의 미세유체 생체역학 소자(microfluidic biomechanical device)를 제안하였다. 기계적인 응력(stress)으로 인한 세포의 변형과 그에 대한 반응인 생체역학적인 효과들을 알아보기 위해서 이 소자에서는 상부채널과 하부채널 사이에 있는 PDMS 멤브레인의 휘어짐을 이용하여 세포에 자극을 주었다. 이 연구는 크게 소자의 제작과 검증 그리고 이 소자를 이용해 세포를 변형시켰을 때 나타나는 특징을 통해 암세포와 정상세포를 구별하는 기술로 구성되어 있다.
먼저 소자의 제작은 multilayer soft lithography (MSL) 기술을 이용하여 제작하였으며, 상부채널(upper channel)은 PDMS 멤브레인을 휘어지게 하기 위해 한쪽 끝이 막힌 제어채널(control channel)이고 하부채널(lower channel)은 주입된 세포가 채널의 바닥에 부착할 수 있는 유체채널(fluid channel)로 구성되어 있다. 제어채널 내에는 유체(물)가 채워져 있으며 이 유체가 채워진 제어채널을 외부의 공기압력 조절기에 의해 압력을 가해주면 채널의 한쪽 면(바닥면)인 PDMS 멤브레인은 휘어지게 된다. 또한, 이 제어채널은 유체채널을 여닫기 위한 밸브(valve)로 기능하는 온칩형 밸브 부분과 유체채널의 바닥에 붙어 있는 세포에 부하를 주는 부하용 멤브레인(loading membrane)부분으로 나뉘어져 있다. 간략히 제작과정을 설명하면, 제어층과 유체층은 실리콘 웨이퍼 위에 각각 negative photoresist (SU-8)와 positive photoresist (AZ4903)로 틀(mold)을 만들고, 이 틀에 PDMS 혼합물(A와 B)를 붓고 경화시켜 만들었다. 특히, 유체층의 positive photoresist (AZ4903) 틀은 reflow process를 통해 단면이 둥근 형태의 채널을 만들었다.
이렇게 제작된 소자의 검증을 위해 다양한 실험들이 수행되었다. 여기서 모든 실험은 세포의 반응을 살펴보기 위한 것이므로 채널의 전처리 과정(세척, 린스, fibronectin 코팅)을 거친 후, 세포를 주입하여 채널의 바닥에 붙이는 과정 후에 진행하였다. 세포를 바닥에 붙인 후 제어채널에 압력을 가하면 PDMS 멤브레인이 휘어져 세포를 압축하게 되어 세포가 변형되게 된다. 특히, 외부의 공기압력 조절기를 통해 공기의 압력을 조절하면 멤브레인을 세밀하게 조절할 수 있다. 이렇게 변형된 세포는 제어채널의 압력을 풀어주게 되면 다시 원래의 형태로 되돌아 오게 되는 것을 확인하였다. 즉, 가역적인 세포의 변형 (reversible cell deformation)을 확인할 수 있었다. 그리고 일정크기 이상으로 세포를 압축해주면 세포막(plasma membrane)에 조그맣게 bulge(부풀어 오르는 것)들이 생성되는 것을 확인하였다. 계속하여 제어채널의 압력을 올리면 세포는 파괴되게 된다. 따라서 이 소자는 세포를 파괴(lysis)하는 소자로도 사용할 수 있음을 확인하였다. 특히, 세포의 파괴는 세포내 물질이 세포가 파괴되는 동안에 변경되면 세포 기반의 assay에서 의미가 없어지기 때문에 빠른 시간 안(500 ms 이내)에 이루어 져야 한다. 이 소자에서는 외부 공기라인의 압력을 조절한 후 on/off 밸브를 이용하여 PDMS 멤브레인을 휘어지게 한 결과 135 ms정도의 빠른 속도로 파괴될 수 있음을 확인하였다. 또한, 온칩 밸브를 조절하여 세포에 압축자극(non-direct contact mode; compressive stress)과 인장자극(direct contact mode; tensile stress)을 가하여 세포의 viability가 자극에 따라 감소하는 것을 관찰하였다.
이렇게 소자의 가능성을 검증한 후, 세포를 크게 변형시킬 수 있는 이 소자의 장점을 이용하여 암세포와 정상세포를 구별하는 데 이 소자를 적용하였다. 우선, 세포 내에는 골격단백질(cytoskeleton)이 존재하여 세포의 구조를 유지하여 주는데 이 골격단백질 중 F-actin은 세포막 밑에 붙어 있어서 세포의 골격 유지와 운동성 등에 영향을 미친다. 그리고 암세포의 경우 이 F-actin과 같은 골격단백질의 양은 정상세포에 비해 현저히 적은 양$(30\sim50%정도)$을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 이 골격단백질 양에 차이가 있는 정상세포와 암세포를 개발된 소자를 이용하여 구별하고자 하였다. 방법은 세포가 크게 변형되면 세포막 표면에 bulge가 생성되는데 이 bulge는 세포막과 골격단백질이 떨어진 곳에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 따라서 골격단백질의 양이 다르게 존재하는 정상세포(MCF10A)와 암세포(MCF7)를 압축하였을 때 bulge의 생성에 따른 차이를 분석하면 두 종류의 다른 세포를 구별할 수 있을 것으로 추정하였다. 이는 마치 실을 감은 고무공을 눌렀을 때 bulge가 생기는 것과 같은 원리로 실이 많이 감긴 고무공 일수록 bulge가 많이 생기고 적게 감긴 공의 경우 bulge가 적게 생긴다고 보면 된다. 이 소자를 이용해 검증해 본 결과 정상세포인 MCF10A의 경우 bulge들이 세포의 가장자리(peripheral length)부분에 고르게 생성되는 반면, 암세포인 MCF7의 경우 불규칙하게 분포되는 것을 확인할 수 있었으며, bulge의 형태도 MCF10A의 경우 튜브형태로 가늘고 길게 돌출되는 것에 비해 MCF7은 크고 볼록하게 돌출되는 것을 볼 수 있었다. 그리고 bulge가 생성되는 순간의 peripheral strain을 계산해 본 결과 MCF10A의 peripheral strain은 46%이고 MCF7은 72%로 차이를 보이는 것으로 분석되었다. 따라서 두 세포 내 골격단백질 양의 차이가 분명하게 존재함을 간접적으로 알 수 있었다. 마지막으로 두 세포 내 골격단백질(F-actin) 양의 차이를 immunostaining을 통해 측정해 본 결과 MCF7이 MCF10A에 비해 35% 가량 적게 존재하는 것을 확인하였다.
세포를 압축하여서 세포막 표면에 생성되는 bulge를 통해 세포의 특성을 분석하고 세포를 구별하는 이와 같은 접근 방법은 세포 내 골격단백질의 양에 차이가 있는 암세포와 정상세포를 구별하는데 효과적으로 사용될 수 있는 방법이라고 생각된다. 또한, 세포를 압축하여 세포에 인장 응력을 줄 수 있는 이 소자는 실험 목적에 따라 약간의 변형을 통해 세포의 변형(deformation)과 강도(rigidity)에 관한 세포의 기계적 특성과 세포막(cellular membrane)의 강건함을 연구하는데 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 기계적인 자극에 대한 세포의 다양한 반응을 연구하기 위한 mechanotransduction 연구(stretch-activated ion channel 등)에도 폭넓게 적용할 수 있을 것으로 보인다.
