Confocal microscopy has been widely used in many industrial and biological researches. There are many aspects to a confocal microscope that make it a much more versatile instrument than other microscopes. Generally the resolution of a confocal microscope is better than a conventional optical microscope by a factor of 1.4. Rejecting out-of-focus images by a pinhole, it can provide optically sectioned images. Unlike scanning electron microscope and other microscopes, it is fast, non-destructive and non-invasive method, so that it can provide 3D imaging sample such as live cells.
Even though confocal microscope has better resolution than conventional optical microscope and optical sectioning capability, it is inherently limited by diffraction theory that the resolution determined by the wavelength of the light and the numerical aperture (NA) of the lenses. As a result of the diffraction the axial resolution is approximately three times poorer than its lateral counterpart.
Several researchers have studied in order to improve axial resolution of confocal microscope. 4Pi confocal microscope, which makes a constructive interference of either the excitation wavefront in the common focus or the detection wave fronts in the common detector pinhole, archived an axial resolution approximately four times higher than that in an ordinary confocal microscope. Modifying the spatial arrangement of the excitation and detection point spread functions in a confocal arrangement or inserting pupil filter in the optical path improve their lateral and axial resolution. Nonlinear nature can be used to improve the resolution of confocal microscope.
In this thesis, a new technique for improving the axial resolution of confocal microscope is proposed. This approach is based on the generation of a frequency domain field confined focal spot, which is made by heterodyne interference between two axially shifted spots. When two beams, which come from same sources but have different frequencies, are focused near the focus of a lens. In the vicinity of overlap region, the interference between two beams is occurred. The frequency of the signal due to the interference, which is known as beating, is the difference of the two frequencies. We can make this region arbitrary small by changing the relative distance between two spots and measure the only signal form the region with a lock-in amplifier.
In confocal microscopy the point spread function (PSF), which is the response of imaging system to a point object, is the product of illumination PSF and detection PSF. We can reduce illumination PSF of a confocal microscope in the axial direction by introducing heterodyne interference between two spot which are separated in the axial direction by a certain distance. Therefore the axial resolution of the confocal microscope is improved. We call this type of confocal microscope as a heterodyne illumination confocal scanning microscope (HICSM).
The three-dimensional imaging equations of the HICSM are derived. Both bright-field and fluorescence imaging are considered. The analytic expression of the 3D intensity point spread function (IPSF) is derived and calculated numerically. The analytical expression for the IPSF of HICSM with a point source and a point detector is same. The further two beams are separated axially, the sharper IPSF is obtained while the height of sidelobes are increased. The numerical results of IPSF show that the full width half maximum (FWHM) is improved by factor of 1.74 maintaining maximum side lobes below 0.5. Also the numerical simulation for a planar object show that at the FWHM of the axial response is reduced to 70% of that of conventional microscope.
We have implemented the system and verified the improvement of axial resolution. All experimental results show good agreement with the simulation results. The axial responses for various objective lenses show that the axial resolution is improved by a factor of 1.38 when $\Delta u$ is about 7.7 in the optical coordinate. Also the image of a gold nano particle of 50nm shows that the axial FWHM is measured to be 2.77um which is improved by a factor of 1.41 compared with conventional confocal microscope. Although the heterodyne illumination approach improves the axial resolution, it has some drawbacks. One drawback is the increased sidelobes, which may degrade the image. However, this increased sidelobes can be removed using linear deconvolution algorithms. Restored x-z image of a gold nano particle show the improved axial resolution without sidelobes.
There are some practical limitations in the HICSM. Spherical aberration, which degrade the performance in conventional confocal microscope, degrades the axial resolution of the HICSM. Spherical aberration brings an asymmetric axial response and increased sidelobes. Also the effect of spherical aberration is discussed both theoretically and experimentally. The size of a confocal pinhole affects the axial resolution of the HICSM. Experimental result recommend that the radius of a confocal pinhole is less than 2.98 in the optical coordinate to obtain a good axial resolution. Another shortcoming of the HICSM is that the intensity of the individual spots used for heterodyne illumination is strong. It wasn’t proven experimentally in this thesis, however, we suppose the strong intensity causes serious photo bleaching and makes it difficult to obtain high quality images in fluorescence imaging. This phenomenon represents a practical limitation to the use of the HICSM in fluorescence imaging.
In conclusion, it is shown both theoretically and experimentally that the heterodyne illumination improves the axial resolution of confocal microscopy by a factor of 1.4 without increased sidelobe. With a HICSM, an axial super-resolution beyond the diffraction limit is achieved.
공초점 현미경은 기존의 현미경에 비해 향상된 분해능과 3차원 이미징을 할 수 있는 광학적 절편 (optical section) 특성을 가지기 때문에 생물학, 의학, 재료공학, 반도체 분야 등에 널리 활용되고 있다. 공초점 현미경은 포인트 소스로 나온 빔이 시편을 조명하고, 형광 혹은 반사된 빛을 대물렌즈의 초점과 공액 관계인 핀홀을 통해서 받기 때문에 기존 현미경에 비해서 분해능이 1.4배 정도 향상된다. 하지만 공초점 현미경 역시 회절에 의해서 분해능이 제한되고, 축방향 분해능은 횡방향 분해능 보다 약 3배가 낮다. 이러한 분해능의 이방성은 3차원 이미징에 방해가 되며, 최근에는 더 작은 대상을 관찰하기 위해서 높은 축방향 분해능이 요구되고 있다.
공초점 현미경의 가장 큰 특징인 3차원 이미징 능력을 향상시키기 위해서 축방향 분해능을 향상시키기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 대표적인 연구로는 4Pi 공초점 현미경, Theta 공초점 현미경, pupil 조작 기술, STED 공초점 현미경 등이 있다.
본 논문에서는 헤테로다인 조명을 이용해서 축방향 분해능을 향상시키는 새로운 방법을 제안하고, 분석하며 적용한다. 제안된 공초점 현미경을 헤테로다인 조명 공초점 현미경 (heterodyne illumination confocal scanning microscope, HICSM)이라고 부른다. 헤테로다인 조명은 서로 다른 주파수를 가진 빔이 공통의 렌즈에 의해서 포커싱될 때 일어난다. 이 때 두 스폿은 동일한 광축을 가지며, 광축 방향의 오프셋을 가진다. 간섭에 의한 성분은 두 스폿의 광분포의 곱으로 주어지게 되고, 두 스폿의 거리를 적절히 조절하면 간섭이 일어나는 부분의 볼륨을 줄일 수 있게 된다. 한편 공초점 현미경의 점 확산 함수는 조명 점 확산 함수와 검출 점 확산 함수의 곱으로 이루어지고, 여기에 앞서 설명한 헤테로다인 조명을 이용하면 조명 점 확산 함수를 축방향으로 더 작게 만들 수 있고, 결과적으로 축방향으로 더 좁은 점 확산 함수를 얻게 되어 축방향 분해능을 향상 시킬 수 있다.
제안된 시스템의 3차원 결상 방정식을 유도 하였다. 이론적인 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 점 확산 함수는 헤테로다인 조명에 의한 점 확산 함수와 일반적인 검출 점 확산 함수의 곱으로 주어진다. 헤테로다인 조명을 발생시키는 두 스폿 사이의 거리가 증가할수록 점 확산 함수의 축방향 반치폭(full width at the half maximum, FWHM)은 줄어들며, 사이드로브의 크기는 증가한다. 이 때 측정되는 신호의 크기는 줄어든다.
유도된 3차원 결상 방정식을 이용하여 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 성능을 분석해 보았다. 점 물체의 영상에 대한 수치분석의 경우 사이드로브의 크기가 메인 로브의 크기의 절반이 될 때, 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 점 확산 함수의 축방향 반치폭은 일반적인 공초점 현미경의 값의 57.5%가 된다. 두 개의 점 물체를 영상화한 경우 두 점 분해능이 약 두 배 정도의 향상을 보인다. 또한 평면 반사체를 영상화한 신호인 광축 응답의 경우 사이드로브가 메인로브의 절반이 될 때, 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 광축 응답의 반치폭은 일반적인 공초점 현미경의 값의 69.0%가 된다.
제안된 헤테로다인 조명 공초점 현미경을 실제로 구성하여 광축방향 분해능이 향상됨을 확인할 수 있었다. 평면 미러를 이용하여 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 광축 응답을 측정한 결과, 스폿의 거리가 멀어질 수록 축방향 분해능이 향상되고 사이드로브가 증가하며 신호의 강도는 작아지는 것을 볼 수 있었다. 다양한 개구수의 대물렌즈에 대한 실험 결과는 수치 분석의 결과의 일치함을 보여준다. 개구수가 0.4인 대물렌즈의 경우, 두 스폿사이의 거리가 2.36um일 때 사이드로브의 크기는 메인로브의 51% 가 되고 광축 응답의 반치폭은 동일한 파장을 사용한 일반적인 공초점 현미경의 값의 71.1%로 줄어드는 결과를 얻을 수 있었다. 한편 사용된 핀홀의 크기는가 커지면 측정되는 신호의 크기는 커지지만 오히려 사이드로브를 증가시켜서 오히려 축방향 분해능을 저하시킨다.
지름이 50nm인 금으로 된 구를 관찰하여 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 점 확산 함수를 측정하였다. 대물렌즈의 개구수가 0.4이고, 두 스폿 사이의 거리가 4.17um인 경우, 헤테로다인 공초점 현미경의 점확산 함수는 축방향 반치폭이 3.12um로 측정되었는데, 이 값은 동일한 파장을 사용한 일반적인 공초점 현미경의 81.4%에 해당되는 값이다.
하지만 헤테로다인 조명 공초점 현미경이 축방향 분해능을 향상시키는 반면, 사이드로브가 발생하게 된다. 이러한 사이드로브는 결과적으로 고스트 영상이나, 측정 오차를 유발하게 된다. 본 논문에서는 사이드로브를 제거하기 위해서 디콘볼루션 알고리즘을 사용하였다. 실험에 의해 측정된 헤테로다인 조명 공초점 현미경의 점 확산 함수와 메인 로브와 사이드로브가 모델링된 로브 함수를 디콘볼루션하여 사이드로브가 제거된 점 확산 함수를 복원할 수 있었다. 따라서 디콘볼루션 알고리즘을 사용하면 사이드로브의 증가 없이 축방향 분해능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
