To enhance the efficiency of xylitol production in Candida tropicalis, we developed XYL2-disrupted mutant, BSXDH-3. We tried to express phosphite dehydrogenase (PTDH) in XYL2-disrupted C. tropicalis to increase economical efficiency and productivity of process of xyltiol production by efficient cofactor regeneration. Firstly, we developed the protein expression system containing the strong constitutive GAP promoter from Pichia pastoris. To confirm the availability of this expression system in C. tropicalis, the expression plasmid harboring XYL2 gene which encodes xylitol dehydrogenase (XDH) of C. tropicalis was constructed and expressed in XYL2-disrupted C. tropicalis. The expression of XDH was verified by XDH activity assay. While the XYL2-disrupted C. tropicalis showed no XDH activity, the recombinant strain showed the specific activity of XDH at the level of 87.91 mU/mg protein in xylose minimal media. This result suggested that th e GAP promoter-based expression system was effective to express the protein in C. tropicalis. Using this expression system, phosphite dehydrogenase (PTDH) from Pseudomonas stutzeri was expressed in the XYL2-disrupted C. tropicalis. The transcription of PTDH gene which was confirmed by RT-PCR was succeeded, whereas the recombinant strain showed no PTDH activity. The codon bias of C. tropicalis was assumed to cause no expression of PTDH. The codon-optimized PTDH gene was synthesized and this gene was also expressed in the XYL2-disrupted C. tropicalis. The recombinant C. tropicalis exhibited the specific activity of PTDH at the level of 14.67 mU/mg protein. The optimization of expression of PTDH will be need to increase the xylitol production afterwards.
자일리톨(Xylitol)은 오탄당 알코올로서, 설탕과 감미도는 같지만 열량은 60%이고 구강 내의 충치 유발균 성장을 억제하고 산의 합성을 유발하지 않는 장점으로 식품산업에서의 이용이 증가하고 있다. 현재 자일리톨은 자연계에 풍부한 반섬유소의 구성물질인 자일로스로부터 화학적인 수소첨가 반응으로 생산하고 있다. 하지만 화학적인 생산 방법은 다단계 정제 과정으로 인한 고비용, 공정의 위험성, 공해 유발의 문제점을 가지고 있어, 저비용, 고수율의 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산기술이 연구 개발되고 있다. 최근 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase; XDH)를 코딩하는 XYL2 유전자를 제거시켜 이론적으로 100%에 가까운 수율의 자일리톨 생산성을 보이는 재조합 균주를 개발되었다. 이 때 세포 성장과 자일로스 환원효소(xylose reductase; XR)의 조효소로 이용되는 NADPH의 공급을 위하여, 글리세롤(Glycerol)을 보조기질로 이용하였다. 하지만 보조기질로 쓰인 글리세롤보다 더 효과적으로 NADPH를 공급할 수 있는 무기질인 포스파이트(Phosphite)를 이용하기 위해, 포스파이트를 포스페이트로 변환시키는 과정에서 NADPH를 공급 할 수 있는 포스파이트 탈수소효소(phosphite dehydrogenase; PTDH)를 발현시켜서 자일리톨 생산공정의 경제성과 생산성을 높이고자 하였다. 먼저 XYL2 유전자를 제거시킨 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)에서 외래 단백질을 발현시킬 수 있는 적절한 프로모터를 찾기 위해서, 캔디다 트로피칼리스와 생리적 특성이 유사한 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)유래의 constitutive GAP 프로모터를 이용한 XYL2 유전자 발현벡터를 염색체에 삽입시켰다. XYL2 유전자가 제거된 균주에서는 자일리톨 탈수소효소의 효소 활성이 측정되지 않았으나 XYL2 유전자를 삽입시킨 재조합 균주에서는 87.91mU/mg protein의 효소 활성을 보였다. 또한 위 constitutive GAP 프로모터를 이용하여 발현시킨 균주는 배지내의 글루코스의 유무와 상관없이 자일리톨 탈수소효소의 활성을 보였다. 이 결과로 피키아 파스토리스 유래의 GAP 프로모터는 캔디다 트로피칼리스에서 외래 단백질을 발현을 시키는데 효과적인 프로모터임을 확인할 수 있었다. 위 GAP 프로모터를 이용하는 슈도모나스 스투쩌리(Pseudomonas stutzeri)유래의 포스파이트 탈수소효소의 발현벡터를 제작한 후, XYL2 유전자가 제거된 캔디다 트로피칼리스에서 형질 전환시켰으나 효소 활성은 확인할 수 없었다. RT-PCR를 이용하여 전사(transcription)되는 것이 확인되었다. 하지만 포스파이트 탈수소효소의 활성은 보이지 않은 것으로 보아 슈도모나스 스투쩌리 유래의 포스파이트 탈수소효소가 캔디다 트로피칼리스의 코돈 사용빈도가 상이하기 때문에 번역(translation)이 억제되는 것으로 추정되었다. 캔디다 트로피칼리스에서의 코돈 최적화를 위하여 포스파이 탈수소효소 유전자를 합성하였다. 코돈 최적화된 포스파이트 탈수소효소는 14.67mU/mg protein의 효소 활성을 확인하였다. 앞으로 포스파이트 탈수소효소의 연구를 통하여 이후 자일리톨 생산 공정의 경제성과 생산성을 향상시키는데 이용할 수 있을 것이다.
