Mammalian spermatogenesis shows a strict control of many specific molecular and cellular events. After two-step meiosis, DNA-protamine-interactions in elongating spermatids result in chromatin condensation causing cessation of transcription at a time when many proteins need to be synthesized and assembled for the complete morphological change. In this step, spermatogenesis occurs with translational control of mRNA which transcribes in early step. It is well-known that cytoplasmic polyadenylation is involved a translational activation of germ cell differentiation. Testis-specific poly(A) polymerase (TPAP), involved in adding poly(A) at the 3’ end of mRNA in haploid germ cells, is highly expressed in round spermatids. In TPAP-deficient mice, expression of haploid-specific genes required for morphogenesis of germ cells is impaired, and poly(A) tails of specific transcription factor mRNAs of round spermatids are not elongated completely. Consequently, these mice are infertile due to spermatogenesis arrest. In spermatogenesis, CPEB-dependent cytoplasmic polyadenylation is related to the formation of early spermatid and CPEB-deficient mice show a different aspect to TPAP-deficient mice. Mice overexpressing TPAP display normal spermatogenesis and fertility, and the mRNA sizes of the transcription factors are unaltered, suggestive of limiting regulatory factors that may act via interactions with TPAP. However, the regulation-mechanism of TPAP is unrevealed. In this thesis, regulatory proteins that would be involved in the regulation of TPAP functions via protein-protein interactions were screened using a yeast two-hybrid assay. Two proteins, germ-cell specific gene 1 protein (GSG1) and testis-specific adenine deaminase (ADAt) were identified as TPAP interaction partner proteins. Although the functions of GSG1 are not known yet, its expression coincides during mouse development. Coimmunoprecipitation assays revealed phosphorylation-independent interactions between TPAP and GSG1 proteins in mammalian cells. GSG1 binds strongly to the catalytic domain, but weakly to the RNA-binding domain of TPAP. Subcellular fractionation analysis showed that GSG1 is exclusively localized in the endoplasmic reticulum (ER) of mouse testis where TPAP is also present. In NIH3T3 cells cotransfected with TPAP and GSG1, both proteins colocalize in the ER. Moreover, expression of GSG1 stimulates TPAP targeting to the ER, suggesting that interactions between the two proteins lead to the redistribution of TPAP from the cytosol to the ER. ADAt differs from ADA in that ADAt lacks the N-terminal region of ADA. ADAt interacted with TPAP more strongly than ADA. Interaction between ADAt and TPAP increased with the treatment of protein phosphatase, suggesting that the dephosphorylated form of ADAt or TPAP, or both proteins are essential for the interaction. Confocal microscopic analysis revealed that ADAt and TPAP colocalize in the cytoplasm, suggesting that ADAt is involved in testis-specific regulation of TPAP in the cytoplasm.
All together, this work discloses novel consequences of protein-protein interaction via TPAP, and would provide a basis for TPAP regulation during spermatogenesis.
포유동물의 정자발생과정은 다양한 특이적 분자들과 세포 내 과정에 의해서 정확하게 조절된다. 정자발생과정 중 연장 정세포 단계에서는, DNA와 Protamine 단백질의 상호작용으로 형태적인 변환과정에 많은 단백질이 필요함에도 불구하고 전사과정이 저해된다. 따라서 이 때는 번역과정에서 조절 작용이 일어나게 된다. 세포질의 폴리(A) 중합과정이 생식세포의 분화과정에서 번역과정을 활성화시킨다는 것은 잘 알려진 사실이다. 세포질에서 정세포의 전사RNA의 3’ 끝에 폴리(A)를 결합시키는 정소 특이적 폴리(A) 중합효소(Testis specific poly(A) polymerase, TPAP)는 원형 정세포에서 많이 발현되며, 이것이 결손 된 쥐는 정자 발생이 중지되었고, 전사조절인자들의 3’ 끝에 폴리(A)의 개수가 감소한 것이 관찰되었다. 또한, 특정 전사조절인자가 핵으로 들어가지 못하는 현상이 보여졌다. 세포질 의 폴리(A) 중합과정에서 중요한 인자로 알려진 CPEB (CPE-binding protein)가 관련된 폴리(A) 중합과정은 TPAP이 작용하는 시기 보다 이전에 작용되며, 실제 CPEB가 결손 된 쥐는 TPAP이 결손 된 쥐와 그 양상이 다르게 나타난다. 이로서, TPAP 이 관련된 폴리(A) 중합과정은 CPEB와 관련이 없을 가능성이 있으며, 독립적인 조절과정으로 이루어질 수 있다고 예측 된다. 그러나, TPAP을 과 발현 시킨 쥐의 경우는 별다른 이상을 발견하지 못하였다. 따라서, TPAP이 정자 발생에 매우 중요한 작용을 하며, 알려지지 않은 특정한 요소에 의해서 조절됨으로써 그 기능을 한다고 예상할 수 있다. 하지만 현재 이 조절과정은 전혀 밝혀지지 않았다. 이 조절 과정을 밝히기 위해서 TPAP과 결합하는 후보 단백질인 생식세포 특이적 유전자 1 단백질 (Germ cell specific gene 1 protein, GSG1), 그리고 정소 특이적 아데노신탈아미노화효소 (Testis specific adenosine deaminase, ADAt)와 TPAP의 상호작용에 대해 연구하였다.
GSG1의 기능은 밝혀지지 않았지만, 그 발현이 TPAP과 비슷한 시기에 나타난다. GSG1은 TPAP의 촉매 작용과 관련된 C-말단 부위(C365)와 강하게 결합하며, RNA와 결합하는 작용과 관련된 부위(366-508)와 약하게 결합한다. 이 결합은 각 단백질의 인산화와 관계없이 이루어지는 것이 관찰되었다. 아미노산의 유사성 비교를 통해, GSG1이 막 구조와 관련된 4개의 나선형 단백질 구조를 가지는 것으로 예측되었다. NIH3T3 세포에서 ER에 존재하는 것을 confocal 현미경을 이용하여 확인하였으며, 쥐의 정소에서도 ER 부분에 존재하는 것이 관찰되었다. 이 때, 쥐의 정소에서 TPAP도 ER에 존재하는 것이 관찰되었다. NIH3T3 세포에서 GSG1을 발현시키지 않았을 때와 발현시켰을 때의 TPAP의 위치를 관찰한 결과, GSG1이 발현되었을 때, TPAP이 ER에 존재하는 것을 확인하였다. 이로서, GSG1은 TPAP과 단백질-단백질 상호작용을 통하여 TPAP의 세포 내 위치를 세포질에서 ER로 바꾸는 기능을 할 가능성을 확인하였다.
ADAt는 정소 특이적으로 발현되는 아데노신탈아미노화효소(Adenosine deaminase, ADA)이며, ADA의 N 말단부분이 결손 되었다. ADA와 ADAt 모두 TPAP과 결합하나, ADAt가 현저하게 TPAP과 강한 결합을 보였다. 이 결합은 단백질 인산화가 되지 않았을 때 더 강해짐을 관찰하였다. ADAt와 ADA 모두 TPAP과 세포질에서 결합된 것이 관찰되지만, 매우 적은 양의 결합을 보이는 ADA와 달리, ADAt는 TPAP과 거의 같은 위치에서 존재하며, 세포질의 특정 위치에 두 단백질이 결합하여 존재하는 것이 관찰되었다. 이로서 ADAt는 TPAP과 정소 특이적인 조절작용에 참여할 가능성이 큼을 예측할 수 있다.
위 연구 내용을 통하여, 그 동안 알려져 있지 않았던 TPAP의 조절작용에 관여할 가능성이 있는 인자를 확인하였고, 그 인자들이 단백질-단백질 상호작용을 통해서 TPAP의 특성에 영향을 미침을 확인하였다. 본 연구는, 정소 특이적인 TPAP의 단백질-단백질 상호작용에 의한 조절 작용 메커니즘에 대해서 초석을 제공한다.
