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Development of fully integrated microfluidic system for detection of intracellular constituents and its applications for infectious viral disease = 세포내 성분 분석을 위한 통합 집적 미세유체 시스템의 개발 및 감염성 바이러스 검출로의 응용연구
서명 / 저자 Development of fully integrated microfluidic system for detection of intracellular constituents and its applications for infectious viral disease = 세포내 성분 분석을 위한 통합 집적 미세유체 시스템의 개발 및 감염성 바이러스 검출로의 응용연구 / Yun-Suk Huh.
저자명 Huh, un-Suk ; 허윤석
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2007].
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Cell lysis, electro-desalting, and sample clean-up by affinity-capturing are used to develop the sample preparation techniques for the embodiment of μ-TAS. And solid phase extraction (SPE) and two phase extraction are demonstrated as the sample separation steps in the microfluidic chip. On the basis of the micro sample preparation steps and separation steps, the fully integrated microfluidic system is developed for detection of intracellular constituents and infectious viral disease. As a first result of sample preparation steps, a microfluidic cell lysis chip equipped with a micro-mixer and solid phase extraction (SPE) was developed and used for quantitative analysis of intracellular proteins. This miniaturized sample preparation system can be employed for any purpose, in which cell disruption is needed to obtain intracellular constituents for the subsequent analysis. This system is comprised of a magnetically actuated micro-mixer to disrupt cells, a hydrophobic valve to manipulate the cell lysate, and a packed porous polymerized monolith chamber to filter debris from the cell lysate. Using recombinant Escherichia coli expressing intracellular enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a model bacterium, we optimized the cell disruption condition with respect to the lysis buffer composition, mixing time, and the frequency of the diaphragm in the micro-mixer, which was magnetically actuated by an external magnetic stirrer in the micro-mixer chamber. The lysed sample prepared under the optimal condition was purified by the SPE packed in the microfluidic chip. At a frequency of 1.96 Hz, the final cell lysis efficiency and relative fluorescence intensity of EGFP after the cell disruption process were greater each by 90% and 94%. Thus, this microfluidic cell disruption chip can be used for the efficient lysis of cells for further analysis of intracellular contents in many applications. As another application of sample preparation steps, the simple and rapid electro-microfluidic desalting system was proposed using the charge characteristics of protein for an effective clean up of protein from urea-rich sample. Upon loading the urea-rich protein sample and the buffer solution into the free-flow zone electrophoresis (FFZE) chamber, the charged protein was separated from non-charged urea in this microfluidic device. The removal efficiency of the urea and the recovery of protein were about 88% and 78%, respectively at 90 V of the electric field in the FFZE chamber. In addition to protein assay, the desalted protein sample used in this device showed a significant improvement in MALDI-TOF-MS spectrum signal of a fusion protein, which was fused to the gold binding polypeptide (GBP) with enhanced green fluorescent protein (EGFP), as a model protein. The inflow of purified fusion protein sample could be successfully immobilized onto the gold surface and analyzed by confocal fluorescence microscopy and surface plasmon resonance for biotechnological sensors. After extracting biomolecules using a lysis buffer including urea, a five-flow microfluidic desalting system was applied for an effective cleaning of protein from a urea-rich protein sample using the copper ion, which has urea affinity-capturing properties. This device effectively removed urea from the sample phase of the microfluidic channel via the diffusion, with difference of the concentration from the sample flow to both sides of the buffer flow, and an affinity of metal ions to the urea between the buffer phase and the affinity phase. The removal efficiency of the urea and the recovery of protein were about 70% and 82% at the concentration of 50 mM Cu2+, respectively. Relative activity of desalted protein was improved more than 15% from the relative activity, with a significant improvement of the signal of mass spectrum shown by MALDI-MS. For the application of μ-TAS, aqueous two phase system (ATPS) and ionic liquid two phase system (ILTPS) were investigated for the removal of hydrophobically contaminated protein and lipids from pretreated sample of purple membrane (PM) as a micro separation step. For the more efficient and higher purification of Bacteriorhodopsin (BR), micro-dialysis was selected for the removal of excessive sucrose after ATPS or ILTPS being performed to remove hydrophobically contaminated proteins as primary separation method in the microfluidic device. In addition, the complex purification method, which combined micro-dialysis with ATPS or ILTPS, was applied to the micro separation step of high purified BR. Our complex purification methods were successfully achieved to purify and recover the BR to its required value. Based on the above results, we describe the complete analytical micro-system which facilitates cell lysis, sample preparation and bio-analysis, by integrating various functional modules into a single chip. A highly effective active micro-mixer utilizing the magnetic force with simple configuration is explored to facilitate the mixing of more than two fluid flows and to integrate microfluidic system which is capable of disrupting and purifying intracellular sample. Upon loading the sample of whole cell and lysis buffer into the mixing chamber, the integrated microfluidic device carries out disrupting intracellular cell by rotation of micro magnetic-disc and manipulation of cell lysate time with valve prepared onto the surface of glass substrate using the hydrophobic film and the micro-pillars. Followed by separating the cell debris and contaminated proteins using the functionalized solid phase extraction from cell lysate sample were performed. The inflow of partially purified lysate sample into gold micro pattern is bound by means of conjugated gold binding polypeptide (GBP), and then analyzed for infectious pathogens. This fully integrated micro device, therefore, could provide a significant contribution to ongoing efforts to miniaturize bio-analysis systems and allow the design and operation of analytical devices for high-throughput applications such as analysis of biomolecules and chemicals.

최근 프로테오믹스가 대두되면서 다양한 신약개발 및 진단 분야에서 분석할 표적 물질들이 급속하게 증가하고 있는 추세이다. 이러한 방대한 양의 생물정보들을 초고속·고감도로 분석, 탐색, 활용할 수 있는 새로운 패러다임의 툴이 요구되고 있다. 이러한 요구에 의해 개발되고 있는 것이 미세통합분석시스템 (Micro-Total Analysis System; μ-TAS) 이다. μ-TAS는 미세분리기술을 이용하여 프로테오믹스를 통해 연구된 다양한 표지단백질에 대한 정보와 시료 단백질에 대한 분석기술을 융합할 수 있는 신 개념의 바이오 칩이다. 미세유체역학(micro-fluidic)을 기반으로 시료의 주입, 반응, 분리 및 검출 등의 모든 과정을 수 cm2 크기의 작은 칩 안에서 처리 함으로서 미량의 시료에 대해 신속하면서도 정확하게 진단하고 시료 채취의 한계가 있는 경우에도 활용이 가능하다는 장점이 있다. 그러나 대부분 질병진단 및 신약개발을 위한 바이오칩은 정제되지 않은 시료를 직접 사용할 수 없으며 별도의 전처리 및 고농도 정제 과정을 통해 얻은 시료를 분석에 이용하고 있다. 최근의 바이오 칩에 대한 연구동향도 정제된 시료를 사용하여 항원-항체 반응과 같은 특정 리간드-수용체 결합이나 표면플라즈몬공명 (surface plasmon resonance) 시스템을 이용한 단백질 분석 및 진단에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 따라서 미세 유체흐름에서의 미세분리기술을 기반으로 한 μ-TAS가 차세대 바이오칩으로 확립되기 위해서는 낮은 농도로 존재하는 다종의 단백질을 빠른 시간 안에 고감도로 분리 및 농축할 수 있는 기술의 개발이 필수적이다. 이러한 미세분리기술에 대한 연구는 프로테오믹스의 발달과 μ-TAS를 통한 수많은 생물정보들을 초고속·고감도로 분리·분석하려는 필요성으로 인해 국내외적으로 활발히 진행되고 있으나 아직까지 상용화된 기술은 그리 많지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 미세 유체흐름을 이용한 μ-TAS를 통해 여러 병원성 질병의 진단 및 새로운 생물분자의 초고속 탐색을 위한 단백질의 시료 전처리 및 미세분리기술에 대한 연구를 수행하였다. 구체적으로, 시료전처리 기술로서 자기력에 의해 구동되는 미세 혼합기를 개발하여 소자 내에서 세포파쇄를 효과적으로 수행하였다. 또한, 미세 채널상에 고상추출제의 충진, 단백질의 전하특성을 이용한 등전집속, 금속이온을 이용하여 과량의 염이 함유된 단백질 시료로부터 탈염 전처리 기술 등을 적용 연구하였다. 이러한 단백질 미세분리기술은 기존의 칩외부 (off-chip)에서 수행되던 시료 전 처리기술을 칩상 (on-chip)에서 신속하면서도 효과적으로 수행할 수 있어 μ-TAS구현에 유용하게 응용될 수 있다. 다단계 전처리 바이오 칩의 연구로서 세포로부터 목적 단백질을 얻기 위한 혼합장치 및 고상추출제 (solid phase extraction)를 동시에 수행할 수 있는 연구와 이상분계 (two phase system) 및 탈염장치를 결합한 미세 분리시스템을 구현할 수 있었다. 최종적으로 미세통합검출시스템의 구현을 위해 요구되는 각 단계의 미세분리기술 및 전처리 기술과 미세패턴검출방법을 미세밸브 및 혼합기를 이용한 결합 및 집적 연구를 수행하였다. 세포 내에 존재하는 병원성 물질이나 표적단백질의 진단 및 검출을 위해서는 세포를 파쇄 하는 단계가 요구된다. 본 연구에서 구현된 통합 집적 시스템에서는 자기장에 의해 구동되는 미세혼합 단계, 세포파쇄 후, 고형물질 (debris)과 불순 단백질을 제거하기 위하여 고상추출제가 충진 되어 있는 정제단계, 금속 미세패턴을 이용한 검출단계로 구성하였다. 또한 본 연구에서는 단백질 활성을 저하시키지 않는 화학용출용액 (Chemical lysis reagent)을 사용하여 급성 호흡기 증후군 (SARS) 질환의 검출을 위한 세포 파쇄를 미세유체소자에서 수행 후, 정제, 분석의 과정을 한 칩 상에 집적하여 수행하였다. 세포 내에 발현된 급성 호흡기 증후군 병원성 물질을 시료 주입 후 20분 이내에 성공적으로 검출할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 통합 집적 미세유체 시스템은 감염성 바이러스 질환의 검출 및 신약 물질개발을 위한 초고속처리검색 (high throughput screening)등을 수행할 수 있게 될 것이다. 또한, 프로테오믹스의 방대한 정보와 단백질분석기술을 융합하는 차세대 바이오칩 연구에 대한 국내의 연구개발에 요소기술로서 활용될 것이다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCBE 07021
형태사항 xiii, 139 : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 허윤석
지도교수의 영문표기 : Won-Hi Hong
지도교수의 한글표기 : 홍원희
수록잡지명 : "Removal of urea from urea-rich protein samples using metal ions in a microfluidic device". Process biochemistry, 42, 649(2007)
수록잡지명 : "Microfluidic separation of (S)-ibuprofen using enzymatic reaction". Journal of molecular catalysis B: enzymatic , 43, 96(2006)
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 생명화학공학과,
서지주기 Includes references
주제 Lab on a chip; sensor; micro-mixer; cell lysis; viral disease; micro sample preparation; micro sample separation
랩온어칩; 센서; 미세혼합기; 세포파쇄; 바이러스질환; 미세 시료전처리; 미세 시료분리
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