Polydiacetylene (PDA)-based biosensors for the detection of biologically important molecules such as protein, DNA, enzyme, and so on have been intensively investigated due to the unique stimuli-responsive color-changing properties as well as fluorescence properties. The purpose of this study is development of a diagnostic technique with potentiality of point-of-care device. PDA biosensors can be applied to detect various biomolecules containing proteins, virus, bacteria, lipophilic enzymes, antibacterial peptide, soluble ions, drugs, pharmacologically active compounds, and so on.
In this study, we describe PDA liposome as a colorimetric biosensor to detect streptavidin (STA), nucleic acid, and GST-fusion recombinant protein and PDA chip as a fluorescence biosensor to detect nucleic acid based on the ligand-receptor interaction. The natural binding of STA for a small vitamin, biotin, has made it a useful tool in specific targeting application, due to their most specific noncovalent biological interactions in nature. Their bond formation is rapid and non-reversible. Here, we modified terminal group of diacetylene monomer with biotin having different spacers to impart a functionality of specific recognition. Prepared biotin-modified PDA liposomes using them showed a color change from blue to red in about 1 hr, upon the addition of STA.
For the selective detection of nucleic acids using a PDA colorimetric sensor, we developed a novel colorimetric detecting method of the polymerase chain reaction (PCR)-amplified nucleic acids based on ionic interaction. In order to induce color change by the ionic interaction between the positively charged PDA and negatively charged phosphate backbone of the nucleic acids, terminal group of diacetylene monomer was modified with positive charged amine groups. The resulting PDA sensors containing functional amine-modified diacetylene monomer showed a dramatic color change from blue to red immediately after the addition of nucleic acids. The prominent advantages of the sensor can detect not only relatively small size of dsDNA, up to ca. 100 bp, but also an extremely small amount, up to 100 nM. We also investigated another colorimetric diagnostic technology for rapid detection of nucleic acid based on intercalation utilizing PDA liposome. From the presumption that exposed intercalator terminal group of the functionalized PDA liposome enables it to insert easily into dsDNA and to induce color transition of PDA liposome, 9-aminoacridine (9AA) intercalator-modified diacetylene monomer was chemically synthesized and used as a functional diacetylene monomer to prepare PDA liposome sensor. As expected, the polyconjugated diacetylene backbone of 9AA-functionalized PDA liposome was stressed by intercalating exposed 9AA into dsDNA to induce selective color transitions of PDA solution.
To verify the expression of glutathione S-transferase (GST)-fusion recombinant protein by utilizing the interactions between GST and the GST substrate, glutathione (GSH), we developed the PDA-based GST colorimetric sensor. A terminal group of PDA monomer was modified with GSH, perpendicular to PDA backbone, enabling its easy interaction with active site residues of GST in solution. The GSH-functionalized PDA liposome containing GSH-modified diacetylene monomer successfully detected both GST and GST-fusion protein (GST-human growth hormone ; GST-hGH) by chromatic transitions from blue to red.
Unlike previous works, the PDA chip as a fluorescence sensor can detect target molecules by fluorescence transitions. It was reported that PDA was non-fluorescent in the “blue state” and fluorescent in “red state”. These properties make it possible that blue-to-red color transitions are accompanied with simultaneous fluorescence transitions. After the preparation of micro-patterned STA-modified PDA glass, we could detect biotinylated nucleic acids through the fluorescence transitions from nonfluorescence to fluorescence on a filter at 532 nm by the biotin-STA interaction. This PDA chip sensor has an advantage that the target nucleic acids are detected by fluorescence signaling change of PDA without time-consuming labeling process of expensive fluorescent agents.
The PDA as a colorimetric biosensor offers the easiest and the most convenient tool because detection can be achieved with naked eyes, expensive equipments are not required for the detection, and ultimately it can be applied to point-of-care testing (POCT). And, the PDA chip sensor decreases time and effort as well as assay cost by not using fluorescence agents. Since these PDA strategies for the detection of biomolecules are simple, rapid, sensitive and practical in both medical and research fields, the PDAs have great potential to be developed as a point-of-care portable sensor for diagnosis fields.
바이오센서는 효소·항체 등의 생물체의 기능물질 또는 미생물 등 생물체가 특정 물질과 예민하게 반응하는 생물 감지 기능을 이용해서, 시료에 함유되어 있는 화학물질을 선택적으로 탐지하는 데 사용하는 화학센서이다. 센서는 외부 환경의 변화를 감지하고 눈에 보이는 변화를 보이면 응용가능성이 커진다. 특히, 장비를 사용하지 않고 육안으로 색 전이를 볼 수 있는 발색 센서는 현장진단 device로 개발할 수 있는 가능성이 크다. 청색의 폴리디아세틸렌 (polydiacetylene; PDA) 리포좀은 다양한 외부자극, 예를 들면 온도, pH, 다양한 생물학적 인식 반응들에 의해 적색으로 색 전이가 일어난다. PDA 센서의 청색에서 적색으로 전이가 일어나는 현상을 이용하여 DNA, 단백질, 효소, 바이러스, 세균 등과 같은 생리활성물질의 탐지를 위한 센서 개발 연구를 해 오고 있다.
PDA는 세포막을 구성하고 있는 인지질과 유사한, 친수성 머리와 소수성 꼬리 구조를 가진 기능성 단량체가 분자간 인력에 의해 self-assembled 이중층을 형성한 뒤 자외선 조사에 의해 단량체 간의 중합으로 청색의 폴리머 구조를 가지게 된다. PDA를 센서로 이용하기 위해, 먼저 단량체의 친수성 머리 부분에는 표적물질을 인식할 수 있는 기능기를 연결하는 화학적 합성 과정을 거치게 된다. 합성된 기능 단량체와 매트릭스 역할을 하는 단량체를 사용하여, PDA 리포좀을 준비한 후, 표적물질과 노출된 기능기 사이의 반응으로 인해 폴리머 backbone 상에 스트레스를 줌으로써 청색에서 적색으로의 색 전이를 확인할 수가 있다.
본 연구에서는 streptavidin (STA), 핵산, glutathione S-transferase (GST)-fusion 재조합 단백질을 색 전이를 통해 탐지하기 위해 다양한 PDA 리포좀 발색센서를 개발하였다. 또한 핵산을 solid 기판 위에서 형광 이미지에 의해 탐지할 수 있는 PDA 형광센서도 개발하였다. STA의 탐지를 위해 STA의 리간드 물질인 biotin을 디아세틸렌 단량체의 terminal 그룹에 화학적 합성반응을 통해 연결시키고, biotin이 노출된 청색의 PDA 리포좀을 형성하여 STA을 색 전이로 성공적으로 탐지할 수 있었다. 또 하나의 중요한 바이오 물질인 핵산을 색 전이를 통해 선택적으로 탐지하고 궁극적으로 DNA 젤 전기영동 없이도 중합연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR)에 의해 증폭된 특정한 표적 유전자의 유무를 확인하기 위해, PDA와 핵산간의 이온결합에 의해 PDA의 backbone에 스트레스를 줌으로써 PDA의 색 전이를 유도시켰다. 이를 위해, PDA의 original 단량체의 terminal 그룹을 양이온을 띌 수 있는 아민 작용기들로 변형을 시키고 아민 작용기를 가진 단량체를 사용하여 PDA 리포좀을 형성시켰다. 형성된 PDA 리포좀의 노출된 아민 작용기들이 핵산과 최적으로 반응할 수 있도록 조성을 조절하여, 작은 사이즈와 적은 농도의 핵산에도 민감한 탐지 기능을 가진 센서를 개발할 수 있었다. 이온결합 반응 외에도, PDA 리포좀의 표면에 intercalator 그룹을 노출시켜 이중가닥 DNA의 double-helix 사이에 intercalation이 이뤄지면 PDA 리포좀의 색 전이를 유도할 수 있었다. 바이오 물질의 대표적인 예인 단백질과 핵산의 탐지 연구 외에도, GST-fusion 재조합 단백질의 발현 여부를 단백질 젤 전기영동 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ; SDS-PAGE) 없이 PDA의 색 전이 여부로 확인할 수 있었다. 표적 물질을 탐지하기 위해, 효소인 GST와 GST의 기질인 glutathione (GSH) 간의 상호작용 원리를 이용했다. GSH sepharose와 GST 간의 affinity binding 원리에 착안하여 GSH를 디아세틸렌 backbone에 수직이 되도록 단량체 말단에 연결시켜 기능성 단량체를 합성하고, 이를 이용하여 GSH-functionalized PDA 리포좀을 형성하였다. GST나 GST-fusion 단백질인 GST-human growth hormone (GST-hGH) 이 첨가되었을 때, PDA의 색 전이를 확인하였다.
색 전이 센서와 달리, PDA를 칩 상에 고정화 시킨 센서는 외부 자극에 의해 PDA가 청색에서 적색으로 색 전이를 보일 때 형광이 없던 상태에서 형광을 보이는 상태로 바뀌는 형광 특성을 이용한다. 우선 glass 상에 biotin작용기를 가진 리포좀을 고정화시키고, STA으로 리포좀의 표면을 다시 변형시킨 뒤 중합하여 청색의 PDA 리포좀이 고정된 칩 센서를 준비했다. biotin을 가진 핵산을 칩 상에서 반응시켰을 때, 532 nm의 파장에서 형광을 성공적으로 탐지할 수 있었다. 이 PDA 칩 센서는 비싼 형광물질을 많은 시간과 노력을 들여가며 레이블링 할 필요가 없다는 점에서 큰 장점을 가진다.
PDA를 발색 바이오센서로 사용했을 때 표적 물질의 존재 여부를 색 전이를 통해 탐지할 수 있기 때문에, 비싼 장비 없이 육안으로 확인할 수 있고 궁극적으로 현장진단용 센서로의 적용이 가능하다. 또한 solid 기판 위에 PDA를 고정화 시켰을 때 형광 물질을 레이블링 할 필요가 없기 때문에, assay 시간과 노력, 비용을 모두 줄일 수 있다. 바이오 물질을 탐지하기 위한 PDA strategy는 가지는 장점으로 인해, 진단 분야에서 현장 진단용 휴대용 센서로 개발될 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있다.
