Anti-HIV peptide T-20 is a polar peptides consists of 36 amino acids corresponding to residues 127-162 in the transmembrane segment of the HIV envelope glycoprotein (gp41) This peptide targets the fusion phase of HIV infection, and is considered to interfere with the conformational changes in gp41 to prevent fusion of viral and host cell membranes. T-20 is the most complex synthetic peptide ever chemically manufactured at a large scale, requiring an unprecedented complexity of manufacturing process that involves 106 production steps, as opposed to 8-10 steps, for typical synthetic process. Therefore, biologic production could be a good alternative solution to the chemical one for mass production of T-20
For production of foreign protein and peptides, medium optimization, strong promoter, and high copy number plasmid were routinely used. These strong expression system can increase the expression of target protein, but it causes serious metabolic load to host cell. Under metabolic load, stringent response occurs. Stringent response is a complicated prokaryotic response system regulates gene expression in transcription level to survive in nutrient depleted condition. On this response, cell stops the producing of foreign proteins and switches the gene expression to its survival. This means protein production machinery of host cell is not fully utilized for enough time. Guanosine tetraphosphate (ppGpp) is the signal and effector molecule of this response. By monitoring the intracellular ppGpp level, the occurrence of stringent response and metabolic load can be determined.
Fed batch fermentation was performed for T-20 mass production with E.coli BL21/pET23a-G3T20 which has isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible expression system. During the fermentation, intracellular ppGpp was measured, and ppGpp was increased from 1.55 umol/gDCW to 4.5 umol/gDCW in a hour after induction. Also cell growth retardation was observed. It might be that induction of target protein expression caused metabolic load to cell and stringent response occurred. For understanding of physiological change of cell under metabolic load, proteome analysis was done for cell w/o induction and cell w/ induction. Many spots were down and up-regulated, but most significant spots were selected and fabD was finally chosen. FabD is malonyl CoA-acyl carrier protein (ACP) transacylase and initiates the fatty acids synthesis. Why fabD was chosen is that it catalyses initiation step of fatty acid synthesis and it was thought that it could increase the cell growth under metabolic load. E.coli BL21/pET23a-G3T20/pACYC-fabD of which fabD gene enhanced was constructed and batch and fed-batch fermentation were performed with this recombinant strain. Introducing fabD increased the T-20/total protein % and T-20 production (Abs.*T-20 %) but decreased the cell growth. Interesting thing was that intracellular ppGpp was maintained as half of the control. It was seems that enhancing fabD caused the decrease of intracellular ppGpp, and decreased ppGpp could not trigger stringent response under metabolic load. As a consequence of these, host cell continued protein expression but could not survive under metabolic load. Finally, 6.14 %of T-20/total protein % and 392.49 of T-20 production (Cell growth*T-20%) was obtained and these values were about 3.5 times bigger than E.coli BL21/pET23a-G3T20 which produced 1.77 % of T-20/total protein % and 143.72 of T-20 production (Cell growth*T-20 %)
항 HIV 펩타이드 T-20은 HIV 막 당단백질 gp41의 막관통 영역의 127-162에 해당하는 36개의 아미노산으로 구성된 극성 펩타이드이다. 이 펩타이드는 HIV감염과정 중 fusion단계를 목표로 하여 바이러스와 숙주세포사이에 fusion 과정에 필요한 gp41 단백질의 변형을 억제하는 것으로 알려져 있다. T-20은 현재까지 화학적으로 대량생산되는 펩타이드들 중 가장 복잡한 형태로 그 생산과정에 106개의 공정이 필요하다. 따라서 T-20의 대량생산을 위하여 이를 대체할 수 있는 생물학적인 공정이 요구된다.
외래 단백질이나 펩타이드의 생산을 위하여 배지 최적화, strong promoter, 높은 copy number의 plasmid등 이 사용되어왔다. 이러한 고발현 시스템은 단기적으로 target 단백질의 생산을 증사시킬 수 있으나 숙주세포에 심각한 대사부하를 유발한다. 이러한 대사부하 하에서 stringent response가 발생한다. stringent response는 영양물질의 결핍과 같은 상황에서 세균이 살아남기 위하여 전사 수준에서 유전자의 발현을 조절하는 기작으로 이 반응이 일어나면 외래 단백질과 같은 단백질의 생산은 정지되고 유전자의 발현이 숙주세포의 생존을 위한 방향으로 전환된다. 이는 숙주세포의 단백질 생산기작이 충분한 시간동안 작용하지 못하고 정지하는 것을 의미한다. guanosine tetraphosphate (ppGpp)는 이러한 반응의 신호 분자인 동시에 작용 분자인 것으로 알려져 있다. 따라서 세포내의 ppGpp의 수준을 분석함으로써 대사부하의 정도와 stringent response의 발생 유무를 판단할 수 있다.
T-20의 대량생산을 위하여 isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)에 의하여 induction 되는 발현시스템을 가진 E.coli BL21/pET23a-G3T20 균주의 유가식 배양을 수행하였다. 배양과정 중 induction이후 한 시간 이내에 세포내 ppGpp의 수준이 1.55 umol/gDCW에서 4.5 umol/gDCW으로 증가하는 것을 관찰하였으며 세포의 생장이 억제되는 것 또한 관찰되었다. 이는 외래 단백질의 발현이 숙주세포에 대사부하를 가져와 stringent response를 발생시키는 것으로 판단되었다. 대사부하 하에서 숙주세포의 생리변화를 분석하기 위하여 induction전과 후의 숙주세포내의 proteome분석을 수행하였다. 단백질의 변화 중 변화의 폭이 크고 숙주세포에 영향이 크다고 여겨지는 fabD 유전자를 선택하였다. fabD 유전자는 malonyl CoA-ACP transacylase를 생산하는 유전자로 이 효소는 지방산 생성과정의 첫 단계를 매개한다. fabD가 강화된 E.coli BL21/pET23a-G3T20/pACYC-fabD을 구축하고 이 균주를 이용하여 유가식 배양을 수행하였다. 배양결과 세포의 생장은 더욱 억제되었으나 T-20/total protein %, T-20 prdoction (cell growth.*T-20 %)의 증가가 관찰되었으며 세포내 ppGpp의 농도가 이전 균주의 절반 미만으로 유지되는 것을 관찰하였다. 이러한 현상은 fabD의 강화가 세포내 ppGpp의 수준을 낮추고 그 결과 대사부하 하에서도 stringent response가 발생하지 않기 때문으로 추정된다. 그 결과 숙죽세포는 대사부하 하에서도 계속해서 외래 단백질을 생산하다가 결국 사멸하는 것으로 보인다. 최종적으로 기존 균주와 비교 하였을 때 E.coli BL21/pET23a-G3T20/pACYC-fabD을 사용함으로서 T-20 %는 1.77 에서 6.14%로, T-20 production은 143.72에서 392.49로 증가된 결과를 얻었으며 이는 약 3.5배의 증가에 해당한다.
