To optimize cell line development process, epigenetic approaches - site-specific recombination and S/MAR DNA regulation elements - were employed. The stability of transgene expression as well as expression level was considered from the initial stages of the cell line development to obtain stable high-level erythropoietin (EPO) producers more easily. Screening of chromosomal locus which guarantees stable and high expression of enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene and subsequent integration of the EPO gene into the screened locus should easily provide promising stable high-level EPO producers. The integration of the desired gene into the screened locus can be efficiently mediated under the function of site-specific recombinases. Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) strategy was employed for the efficient site-specific recombination among various site-specific recombination strategies since it has been regarded as one of the most powerful tools for gene targeting.
For the stable integration of a transgene by the RMCE strategy, spacer mutant recognition target, which is incompatible with wild-type sequence and mediates efficient site-specific recombination, is indispensable. Therefore, a simple and accurate analysis system for the estimation of recombination efficiency in vivo using fluorescence-activated cell sorting (FACS) was designed and was subsequently used to compare the efficiency of recombination related to different spacer mutant. $F_3$ and $F_5$ mutant sequences were used for Flpe-mediated cassette exchange, and m2 and lox2272 mutant sequences were used for Cre-mediated cassette exchange due to their high incompatibilities with wild-type sequences. The incompatibilities with wild-type were almost the same between mutant sequences. However, the recombination efficiencies were different. $F_3$ and m2 could mediate more efficient recombination than F5 and lox2272, respectively. These results are consistent with the fact that the sequence of spacer region affects not only the reactivity upon wild-type sequence but also the recombination efficiency. It was also confirmed that the recombination process was mediated in a site-specific manner through PCR analysis using different sizes of exchange cassettes.
Based on the result of mutant sequence evaluating system using FACS, F3 and Flp-mediated cassette exchange were employed to obtain a stable high-level EPO producer. A ‘stable parental clone’ (FC28), which mediated stable and high expression of EGFP gene, was screened by extensive flow cytometric analysis. Using Flp-mediated cassette exchange, the EPO expression unit could be correctly targeted into the stable parental clone and a CHO cell line which produced EPO stably and relatively largely (FC28T7) could be obtained without gene amplification. The EPO production level of FC28T7 was approximately 10-fold higher than that of the non-amplified EPO pool and comparable to that of EPO 05-8, which was cloned from the EPO pool amplified at 5 nM MTX. While EPO 05-8 lost its specific productivity up to 72% after long-term cultivation, FC28T7 maintained stable production EPO production. Although the targeting efficiency needs to be improved, the feasibility of Flp-mediated cassette exchange for establishing a CHO cell line stably producing EPO was verified. It was also clarified that the Flp-mediated cassette exchange did not alter the parental clones’ characteristics concerning the stability of transgene expression.
To understand the site-specific recombination process in detail, the site-specific recombination event by Cre-mediated cassette exchange during the development of EPO producing CHO cell lines was characterized. Correctly targeted clones producing EPO were obtained from 5 parental clones by Cre-mediated cassette exchange with 0-17% of targeting efficiencies. Positive relationship between green fluorescence intensities of parental clones and specific EPO productivities of their correctly targeted clones was also observed. Therefore, it was verified that the chromosomal loci’s characteristic regarding gene expression was not modified after Cre-mediated cassette exchange.
In an effort to verify the feasibility of combined use of S/MAR elements with site-specific recombination for the enhancement of EPO production, the effect of S/MAR elements was investigated. The integration of EPO expression unit flanked with two human interferon-β S/MAR elements increased the specific EPO productivity of EPO parental pool up to 300% when compared to the integration of only the EPO expression unit. However, the combined use of the human interferon-β S/MAR element with Cre-mediated cassette exchange could not enhance the specific EPO productivity.
From the research on the development of CHO cell lines producing EPO using site-specific recombination, following results were obtained.
First, a simple and accurate analysis system for the estimation of recombination efficiency using FACS was developed. This system should be readily applicable for estimating recombination efficiency of other various mutant candidates, which will contribute to more precise and efficient site-specific recombination.
Second, a stable high-level EPO producer was obtained by Flp-mediated cassette exchange. The site-specific recombination event by Cre-mediated cassette exchange was also characterized. Based on the data acquired from these site-specific recombination experiments, it was verified that the recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) did not modify the parental clones’ characteristics concerning transgene’s expression level and stability. Therefore, stable and high-level production of any desired protein is expected to be accomplished by targeting of transgene targeting vectors into the selected ‘stable parental clone’ by RMCE.
Third, the use of human interferon-β S/MAR element was effective on enhancing the specific EPO productivity of EPO parental pool. However, there was no supplementary effect of the element with site-specific recombination on enhancing the specific EPO productivity of targeted clone. Therefore, the investigation of the effect of various DNA regulating elements including other kinds of S/MAR elements on the transgene expression should be further study.
CHO세포주 제조의 초기 단계부터 도입된 유전자의 발현량뿐만 아니라 발현의 안정성을 고려하고, 다양한 epigenetic approach (위치특이적 재조합, S/MAR DNA elements)를 통하여, 기존의 세포주 제조 과정을 최적화하고자 하였다. 도입된 유전자를 안정적으로 높은 농도로 발현하는 염색체상의 자리를 선별하고, 이 자리에 실제 발현시키고자 하는 단백질에 대한 유전자를 위치특이적으로 삽입함으로써, 안정한 고발현 세포주를 얻을 수 있을 것으로 기대하였다. 외부 유전자의 위치특이적 삽입을 위해, 유전자 표적화 (gene targeting)를 가장 효과적으로 수행하는 위치특이적 재조합의 방법 중 하나로 알려진 RMCE (recombinase-mediated cassette exchange) 가 이용되었다.
RMCE를 이용한 효율적인 위치특이적 재조합을 위해서는 위치특이적 재조합 효소의 wild-type 인식 부위와 반응성이 없는 mutant 인식 부위의 선별이 필수적이다. 따라서, FACS (fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여in vivo 상에서 다양한 mutant 인식 부위의 wild-type 과의 반응성과 위치특이적 재조합을 매개하는 효율을 조사할 수 있는 시스템을 개발 하였다. 지금까지 보고된 wild-type과의 반응성을 기준으로Flpe-mediated cassette exchange의 경우 $F_3$와 $F_5$ mutant 인식 부위를 후보군으로, Cre-mediated cassette exchange의 경우 m2와 lox2272 mutant 인식 부위를 후보군으로 각각 선별하였다. 예상했던 바와 같이 모든 mutant 인식 부위들의 wild-type과의 반응성은 매우 낮은 수준으로 차이가 없었다. 그러나, 위치특이적 재조합을 매개하는 효율성 측면에서는, $F_3$와 m2가 각각 $F_5$와 lox2272에 비해 더 효율적으로 재조합을 매개함을 확인하였다. 이러한 결과는 mutant 인식 부위의 spacer 부분의 염기서열이 wild-type과의 반응성뿐만 아니라, 재조합 효율 자체에도 영향을 미친다는 기존의 보고와 일치하였다. 또한, 재조합 산물의 PCR 분석을 통하여 재조합이 위치특이적 방법을 통해 이루어졌음을 확인하였다.
FACS 분석 시스템을 통해 선별된 $F_3$ mutant 인식 부위와 Flp-mediated cassette exchange를 이용하여, EPO를 안정적으로 고발현하는 CHO 세포주를 확립하였다. 녹색 형광 단백질 (EGFP)을 안정적으로 고발현하는 ‘안정한 모세포주 (stable parental clone)’ (FC28)를 선별하고 Flp 재조합 효소를 이용하여 EPO 단백질의 유전자를 FC28에 위치특이적으로 삽입함으로써 증폭 없이, EPO를 안정적으로 고발현하는 표적화된CHO 세포주 (FC28T7)를 선별하였다. FC28T7의 단위세포당EPO 생산속도 (EPO 생산성)는 EPO parental pool에 비해 약 10배 높았으며, 5 nM에서 증폭된 pool에서부터 클로닝된 EPO 05-8과 거의 유사하였다. 장기 배양을 통해 EPO의 생산 안정성을 조사한 결과, EPO 05-8의 EPO 생산성이 60일 이후 처음 EPO 생산성의 28% 수준으로 감소한 것과 달리, 표적화된 CHO 세포주인 FC28T7은 안정한 EPO 생산성을 유지하였다. 따라서, EPO 생산 안정성과 관련된 염색체상의 자리의 특성이 Flp-mediated cassette exchange에 의해 훼손되지 않았음이 확인되었다.
Cre-mediated cassette exchange를 통해 EPO 생산 CHO 세포주를 만드는 과정에서 위치특이적 재조합 반응의 특성을 조사하였다. 5개의 모세포주에서 EPO 유전자가 정확히 표적화된 세포를 얻을 수 있었으며, 표적화 효율은 0-17% 였다. 또한, 모세포주의 녹색 형광 발현 정도와 표적화된 세포의 EPO 생산성 사이에 상호 관련이 있음을 확인하였다. 이는 염색체상의 자리의 유전자 발현에 관련된 특성이 Cre-mediated cassette exchange 이후에도 변하지 않았음을 의미하였다.
또한, S/MAR element가 EPO 생산성에 미치는 효과를 조사하였다. EPO 유전자의 양쪽을 인간 인터페론-베타 S/MAR element (human interferon- S/MAR element)로 flanking 하고 CHO 세포 내로 도입하여 EPO parental pool을 확립하였을 때, EPO 유전자만을 도입하였을 때에 비해 약 3배 가량 향상된 EPO 생산성을 확인하였다. 하지만, 인간 인터페론-베타 S/MAR element를 위치특이적 재조합과 같이 적용하였을 경우, 부가적인 EPO 생산성의 증가 효과는 관찰되지 않았다.
위치특이적 재조합 효소를 이용한 EPO 생산 CHO 세포주 개발에 관한 연구를 통하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
첫째, mutant 인식 부위가 관여하는 재조합 반응의 효율성을 평가할 수 있는 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 어떤 mutant 인식 부위에 대하여도 쉽게 적용될 수 있으며, 따라서 보다 정확하고 효율적으로 위치특이적 재조합을 구현하는데 기여할 것으로 기대된다.
둘째, 안정적인 EPO 고발현 세포주를 Flp-mediated cassette exchange를 통하여 확립하였다. 또한 Cre-mediated cassette exchange에 의해 매개되는 위치특이적 재조합 반응의 특성을 조사하였다. 이를 통해, recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) 가 모세포주의 외부 유전자 발현 및 생산 안정성에 관련된 특성을 변화시키지 않음을 확인하였다. 따라서, 다양한 단백질에 대한 유전자를 앞서 확립된 안정한 모세포주에 표적화함으로써, 다양한 단백질의 안정한 고농도 생산을 실현할 수 있을 것으로 기대된다.
셋째, 인간 인터페론-베타 S/MAR element가 EPO parental pool의 EPO 생산성을 약 3배 증가시켰다. 그러나, 위치특이적 재조합과 동시에 적용되었을 때, 부가적인 효과는 관찰되지 않았다. 따라서 인간 인터페론-베타 S/MAR element 이외에 다양한 DNA 조절 인자의 효과에 대한 연구가 필요할 것이다.
