Confocal microscopy has been a versatile tool for investigating various specimens in bio-science, material science, semi-conductor industry, and etc. Recently, it is widening the application to the bio-medical fields along with the confocal endo-microscopy. However, due to the well-known resolution limit in light microscopy, some researchers inevitably find alternatives, such as atomic force microscopy or scanning electron microscopy, enduring the complicated preparation, time-consuming process, sample damage, and limited use in fluorescent applications.
Thus researchers have proposed many ideas to overcome the resolution limit by far-field imaging, such as 4-pi confocal microscopy, two-photon microscopy, structured illumination microscopy, point spread function engineering, stimulated emission depletion microscopy (STED microscopy), confocal self-interference microscopy, and etc. Among them the STED microscopy is a promising technique for high spatial resolution. It achieves the higher resolution over the conventional confocal microscopy, by applying additional STED pulse only at the outer region of the excitation pulse. STED pulse depletes the excited fluorophore by the depletion process, named stimulated emission depletion, thus it leads the reduction of full-width at half-maximum of the effective intensity point spread function. It has theoretically unlimited resolution. The experimental verification of the resolution shows that 30nm in both transverse directions have been achieved and about 30nm in axial direction has been acquired, individually.
One of the mainly required techniques in the STED microscopy is applying the beam-scanning optics. Until now the STED microscopy uses the sample scanning method to require 2- or 3-dimensional image. This causes the slow scan speed and vibrational problems. Thus, in this study the beam-scanning STED microscopy is proposed. In order to scan the laser beam, the two-axis galvanometers are used since it has sufficient speed and high optical efficiency. The relay optics is necessary to ensure that the scanned beam enters the back aperture of the objective lens. In fact, the beam-scanning optics induces aberration problem, which degrades the performance of the STED microscopy. It leads us to solve the aberration problem as well as the beam-scanning method.
The wavefront RMS is examined for the performance evaluation. The numerical analysis shows that much aberration is induced in this scanning part. The objective lens and the specimen also produce the unwanted aberrations. The numerical simulation to analyze the effects on the performance in STED microscopy shows that the STED microscopy is more sensitive to the aberration than conventional confocal microscopy. Thus we need to correct the aberration induced in the optical components, especially beam-scanning part, since the main advantage of STED microscopy is to get a high resolution image.
To get an aberration-free optical system is maybe one of the wishes of the optical engineers, since the unwanted aberration can ruin the total optical system. Even though it is impossible to completely eliminate the aberration from the optical system, we can reduce it dramatically using the adaptive optics, which has been widely used in astronomical telescopes. Several methods of aberration correction in imaging system, especially in microscopy, are described. For an aberration sensing and an aberration correcting, the Shack-Hartmann sensor and the micro-machined membrane deformable mirror are introduced. Simple adaptive optics system for the feasibility test is presented using them along with the experimental results. The result shows that using the SHS and the MMDM the aberration can be reduced in imaging system. For the aberration feedback, singular value decomposition is used to find the orthonormal modes of mirror deformations.
The aberration correction methods for the beam-scanning STED microscopy is presented based on the adaptive optics, using the SHS and the MMDM. According to the position of the SHS the aberration from the objective lens and the specimen can be compensated as well as one induced from the scanning optics by simply inserting the SHS and the MMDM. In this study only the aberration, that is induced by the optical components of beam-scanning STED microscopy, is compensated. We can also generate the specific aberration to study the effects of aberrations with the experiments.
The method of measuring the point spread function by the fluorescent micro sphere is presented. We also use the line object to measure the 1-directional point spread function, then we can calculate the optical transfer function (OTF). Using the deconvolution technique, we can measure the point spread function of the imaging system with relatively large bead. If the object size is sufficiently small, we do not have to apply a deconvolution technique to get the exact point spread function. The line fluorescent object is prepared to measure the intensity point spread function directly.
The experimental results show that the improvement of the resolution with the beam-scanning STED microscope over the confocal microscope. The Full-width at half-maximum (FWHM), which represents the lateral resolution, is 209nm and 142nm for confocal microscopy and STED microscopy, respectively. It is improved by 32% in x-direction. The OTF is also improved in STED microscopy. The cutoff frequency of OTF for confocal microscopy and STED microscopy is $4.4um^{-1}$ and $9.4um^{-1}$, respectively. It is improved by 114%.
We analyze the effects of the aberrations with experimental data. From the experimental results and the numerical analysis with aberrations, we can confirm that the effects of aberrations are greater in STED microcopy than in confocal microscopy by a factor of 2 to 4. The resolution degradation is greater and the intensity drops quickly. Thus we conclude that the aberration in STED microscopy has to be seriously treated more than in usual imaging systems. The allowable aberration condition is presented as it should be less than 0.03λ . Especially, when the complicated optics is used, such as beam-scanning components, the aberration should be strictly controlled.
In conclusion, the beam-scanning STED microscopy has a capability of a fast high resolution imaging over the diffraction limit. Experimental results verify that. Also, the results of the analysis on the effects of aberrations tell us that we must control the aberration more strictly in STED microscopy. With the aberration correction system, we can prevent the degradation due to the aberration, caused by the optical elements. Beam-scanning STED microscopy is expected to be widely used for high resolution fluorescent imaging, especially which can not be imaged with other fluorescent microscopes.
공초점 현미경은 생물학, 재료과학, 반도체 산업 등 다양한 시편을 조사하는데 광범위하게 사용되고 있다. 최근, 공초점 내시경을 통해서 생의학 분야로 응용 분야를 넓히고 있다. 하지만, 광학 현미경에서 잘 알려진 회절에 의한 분해능 한계로 인해, 많은 연구자들은 복잡한 준비과정, 측정 시간의 낭비, 샘플 파괴, 형광 사용의 제약 등의 약점에도 불구하고 불가피하게 원자현미경이나 전자 현미경과 같은 다른 고분해능 현미경을 이용하고 있는 실정이다.
따라서 많은 연구자들이 광학 현미경의 분해능 한계를 극복하기 위해 4-pi 공초점 현미경, 이광자 현미경, structured 조명 현미경, PSF 조작, STED 현미경, 자가간섭 현미경 등 다양한 방법으로 연구를 하고 있다. 그 중 STED 현미경은 고분해능을 얻기 위한 중요한 기술로 부각되고 있다. 여기된 형광의 주변 부분에 별도의 STED 빔을 조사해 줌으로써, 기존 공초점 현미경보다 높은 분해능을 획득할 수 있다. STED 빔은 유도 방출 소멸이라 불리는 방법으로 여기된 형광의 에너지를 제거하여 점 확산함수의 반치폭을 감소시키게 된다. 실험적 제약이 없다면, 이론적으로 분해능의 한계 없이 높은 분해능을 얻을 수 있다. 기존 연구 결과에서 약 30nm 의 분해능을 얻을 수 있음을 알 수 있다.
STED 현미경에서 가장 필요한 기술 중에 하나는 빔 주사 방식을 적용하는 것이다. STED 현미경은 점 주사 방식으로 2차원 혹은 3차원 영상을 얻기 위해서 시편을 움직이는 방법을 사용하였다. 이러한 방법은 속도가 매우 느리고, 진동에 취약하다는 문제점이 있다. 따라서, 본 연구에서는 빔 주사 방식 STED 현미경을 제안한다. 레이저 빔 주사를 위해 충분히 빠른 속도를 갖고 광 효율이 좋은 2축 갈바노미러가 사용되었다. 빔의 각도를 바꿔 주어도 빔이 대물렌즈의 구경을 정확히 향할 수 있도록 릴레이 광학계가 필수적이다. 이 때, 빔 주사를 위한 광학 요소들이 수차 문제를 유발하게 되는데, 이것은 STED 현미경의 성능을 저하시키게 된다. 따라서 본 논문에서는 주사 방법에 관한 문제뿐 아니라 수차에 관한 문제 해결을 위한 연구를 수행하였다.
성능 분석을 위해 파면 오차의 RMS 값을 조사하였다. 시뮬레이션 결과에서 많은 수차가 빔 주사를 위한 부분에서 유발됨을 알 수 있다. 완벽하지 못한 대물렌즈와 수차에 의해서도 원치 않는 수차가 유발될 수 있다. 수차가 STED 현미경의 성능에 어떤 영향을 미치는지 분석해 본 결과, STED 현미경은 일반적인 공초점 현미경보다 수차에 더욱 민감함을 알 수 있다. 따라서, STED 현미경의 장점인 고분해능 영상을 얻기 위해서는 광학계, 특히 빔 주사를 위한 부분에서 발생하는 수차를 적절히 제어할 필요가 있다.
수차는 전체 시스템의 성능에 악영향을 미치기 때문에, 수차가 없는 광학 시스템을 만드는 것은 광학 엔지니어의 희망 사항 중 하나이다. 비록 수차를 완벽히 제거하는 것은 불가능하더라도 적응 광학계를 이용하여 수차를 많이 줄일 수 있다. 적응 광학계는 지금까지 천문학 연구를 위한 고성능 망원경에서 널리 사용되어왔다. 광학 현미경 시스템에서 사용될 수 있는 몇 가지 수차 보정 방법을 제시하였다. Shack-Hartmann 센서와 micro-machined membrane deformable mirror가 수차 측정과 보정을 위한 도구로 소개하였다. 가능성 검토를 위한 간단한 적응 광학계 시스템을 이용하여 실험을 수행하였다. 수차의 보정을 위해서 singular value decomposition 방법이 사용되었다.
빔 주사 방식 STED 현미경에서 수차 보정을 위해 SHS와 MMDM을 이용한 수차 보정 방법을 제안하였다. 본 연구에서는 빔 주사 방식 STED 현미경의 광학 부품에 의해 유발되는 수차만 제거하기로 하였다. 또한 이 시스템을 이용하여 특정한 수차를 유발할 수 있고, 실험 결과를 통해 수차가 STED 현미경의 성능에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다.
형광 마이크로 비드와 형광 선 물체를 이용하여 점 확산 함수를 측정할 수 있는 방법을 제시하였고, 이 결과를 이용하여 전달 함수를 계산할 수 있다. Deconvolution 기술을 이용하면 보다 큰 물체를 이용한 실험으로도 정확한 점 확산 함수를 얻어낼 수 있다. 충분히 작은 크기의 물체를 사용한다면 deconvolution 기술을 적용하지 않아도 영상을 촬영함으로써 점 확산 함수를 직접적으로 측정할 수 있다. 실험을 위해 형광 선 물체를 준비하였다.
실험 결과를 통해 수차가 보정된 빔 주사 방식 STED 현미경의 분해능이 기존 공초점 현미경에 비해 향상됨을 확인할 수 있다. 분해능을 대표하는 반치폭이 공초점 현미경과 STED 현미경에서 각각 209nm 와 142nm 로 측정되었다. STED 현미경에서 약 32% 향상된 결과이다. 전달 함수를 분석해 본 결과 공초점 현미경의 최대 공간 주파수는 $4.4um^{-1}$ 인데 비해, STED 현미경에서는 최대 공간 주파수가 $9.4um^{-1}$ 로 측정되었다. 수치적으로 약 114% 향상된 결과이다.
실험을 통해서 수차의 영향에 대해 분석해 본 결과, 공초점 현미경에 비해 STED 현미경이 약 2-4배 정도 수차에 더 민감함을 확인할 수 있었다. 분해능 감소가 더 심하게 나타났고, 신호의 세기도 더 빠르게 감소하였다. 따라서 STED 현미경에서는 일반적인 현미경에서보다 더 엄격한 수차에 대한 기준이 필요함을 알 수 있다. 허용될 수 있는 수차의 기준으로 파면 오차의 RMS가 0.03λ 보다 작아야 한다는 기준을 제시하였다. 특히 빔 주사 방식과 같은 복잡한 광학계가 사용될 경우, 수차를 엄격하게 통제해야 한다.
시험 결과에서도 확인할 수 있듯이 빔 주사 방식 STED 현미경은 회절에 의한 분해능 한계를 뛰어넘는 고속, 고분해능 현미경이다. STED 현미경은 수차에 매우 민감하기 때문에, 수차를 엄격히 다루어야 한다. 본 연구에서는 수차 보정 시스템을 통해 STED 현미경의 성능 저하를 막을 수 있었다. 기존 현미경으로는 관찰할 수 없었던 미세한 구조를 관찰할 수 있기 때문에, 수차가 보정된 빔 주사 방식 STED 현미경은 고속 고분해능 형광 영상 연구에 널리 사용될 것으로 기대된다.
