The mRNA of Escherichia coli yedU gene is induced upon heat shock. The 31kDa YedU protein is a homodimeric protein consisting of a large A domain and a smaller P domain connected by a linker. Especially, the P domain is responsible for dimer formation through inter-subunit interactions. Crystal structures of YedU indicate that it exists in two different forms. The flexible region, D2 and D3, of form I are ordered, whereas that of form II is disordered. The flexibility in a number of intra-domain linker regions found in the form II indicates a role of YedU in chaperone action.
With the purified protein, we detected two major peaks of YedU protein, separated by anion-exchange chromatography, while catalytic mutants, E77A, C185A, C185D, and H186A, generated only the first peak, which is consistent with iso-electric focusing result. To gain further insight into their conformation, we measured the circular dichroism (CD) spectra of different YedU peaks, in which peak 1 contains α-helical and ß-sheet structures of 26% and 24%, respectively, and peak 2 with 16% α-helix and 32% ß-sheet.
Based on three tryptophan residues of YedU, the equilibrium folding behaviors of YedU protein were examined by fluorescence spectroscopy. The peak 1 of YedU exhibited a fluorescence maximum at 348 nm, whereas the peak 2 exhibited a much lower intensity with maximum at 336 nm. Although we did not detect remarkable drop of fluorescence intensity, maximum fluorescence $(\lambda_{max})$ shifts to shorter wavelength as GdnHCl concentration or temperature increases. The equilibrium unfolding data indicates two-state transition involving the native and unfolded states. Although the CD data exhibits slightly different secondary structural contents from the calculated one of crystal structure, it is likely that the peak 1 and peak 2 represent two different conformational states of YedU due to a flexibility involving the D2 region.
대장균 yedU 유전자의 mRNA는 열충격에 의해서 유도된다. 31kDa 크기의 YedU 단백질은 큰 A 도메인과 작은 P 도메인 분자로 이루어졌으며, 연결자(linker)를 통해 연결된 동종이중체(homodimeric) 단백질이다. 특히, P 도메인은 각각의 단위체들 상호작용을 통해 형성되는 이중체 구조를 이루는데 중요한 역할을 한다. YedU 단백질의 결정 구조를 통해서 2가지 형태로 존재하는지 알 수 있었다. 2가지 형태 중, 구조1의 유연한 연결자 부분(D2,D3)는 잘 정렬되어 있는 반면, 구조 2에서의 그 부분은 흐트러져 있다. 단위체 내에서 연결자 부위의 유연성은 구조 2에서 YedU 단백질이 샤페론(chaperon) 기작에 중요한 역할에 기여한다.
변형되지 않은 YedU 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피로 분리하면 YedU 단백질은 2개의 봉우리(peak)로 보이는 반면, 촉매부위(catalytic triad) 돌연변이 단백질은(E77A, C185A, C185D, and H186A) 변형되지 않은 단백질의 중 첫 번째 peak와 일치하는 위치에서 한 개의 봉우리로 분리된다. 이는 IEF 젤(gel)에서의 결과와 일치한다. 더 자세한 형태적 특징을 관찰하기 위하여, 서로 다른 2개의 peak으로부터 얻어진 단백질을 원편광 이색성 분광 분석(Circular dichroism, CD) 하였다. peak 1은 알파 나선(α-helix) 26%, 베타 평면(ß-sheet) 24%로 나타났으며, peak 2는 알파 나선 26%, 베타 평면24%이였다.
YedU 단백질의 트립토판에 기초, 형광 분광 광도계를 사용하여 평형상태의 접힘(folding)을 관찰하였다. YedU의 peak 1은 348nm위치에서 최대 형광을 나타낸 반면에, peak 2는 336nm 파장에서 최대형광을 보였다. 염산 구아니딘(Guanidine hydrochloride)의 양이나 온도를 높여감에 따라 형광의 급격한 변화를 관찰하지는 못하였으나, 최대 형광을 나타내는 파장은 급격한 변곡 부분을 가지며 짧아졌다. 평형상태의 풀림(unfolding) 실험을 통해 우리는 2개의 과도기적 상태가 YedU단백질에 존재함을 알았다. 비록 원편광 이색성 분광 분석(CD) 결과가 기존에 알려진 단백질 구조를 통해서 밝혀진 결과와 정확히 일치하지는 않지만, peak 1과 peak 2는 YedU 단백질의 2가지 구조적 상태를 반영한다고 볼 수 있으며, 이는 D2지역의 유연성과 관계 있다고 여겨진다.
