D-Hydantoinase from Bacillus stearothermophilus SD1 is an important enzyme to synthesize commercially important non-natural amino acid but it has relatively low activity for aromatic hydantoin derivatives. Previously it was proven that the stereochemistry gate loops (SGLs) in the substrate binding pocket of D-Hydantoinase, $(\beta/\alpha)_8$-barrel enzyme, are major structural determinants of the substrate specificity. Based on previous studies, we attempted to computationally design the D-hydantoinase to improve specificity for hydroxyphenylhydantoin (HPH), and to provide D-p-HPG, a commercially important non-natural amino acid. Target amino acid sites were determined by experimental and structural analysis of active site of Hydantoinase. We selected Met63 and Phe159 amino acid sites on SGLs because they contact with hydroxyl ring of HPH. The result of first round was not good enough for prediction. But as the parameters of scoring function were optimized by feedback of experimental results, improved scoring function predicted another candidate sequences and we produced Hydantoinase with 4.5 times and 5.3 times higher specific activity toward HPH than wild type enzyme in second round and third round. In terms of specificity (HPH/hydantoin), improvement was 41 times and 135 times higher than wild type. Through the rational analysis of mutant activities which were designed by computational modeling, we supposed that $63^{rd}$ and $159^{th}$ amino acid residues have complementarities in amino acid side chain length. Except mutants of the highest activity, the others showed decreasing tendency when side chain lengths in $63^{rd}$ amino acid site are longer or shorter than that of the high mutants.
바실러스 스테아로써모필러스 SD1 (Bacillus stearothermophilus SD1) 의 D-히단토이네이즈(D-Hydantoinase)는 상업적으로 중요한, 자연계에 존재하지 않는 아미노산을 합성하는 중요한 효소이지만, 그것은 아로마틱 하이단토인 (aromatic hydantoin) 유도체에 대해 낮을 활성을 가지고 있다. 이미 D-하이단토이네이즈의 기질 결합에 있는 광학적 이성질체 결정 고리 (stereochemistry gate loops, SGLs) 가 기질특이성의 구조적 결정인자임을 밝혔다. 이전의 연구를 바탕으로 하여 우리는 컴퓨터를 이용하여 하이드록시페닐하이단토인(hydroxyphenylhydantoin, HPH)에 대한 기질특이성을 개선시키기 위해 상업적으로 중요한 자연계에 존재하지 않는 아미노산인 D-p-하이드록시페닐글라이신(D-p-HPG)을 만들어주는 D-하이단토이네이즈를 설계하였다. 표적 아미노산의 위치는 하이단토이네이즈의 활성부위의 실험적, 구조적인 분석을 통해 결정되었다. Met63과 Phe159가 하이드록시페닐하이단토인의 하이드록실 고리와 인접하기 때문에 우리는 광학적 이성질체 결정 고리에 존재하는 Met63과 Phe159 아미노산 위치를 선택했다. 첫번째 실험의 결과는 예상한 것과 차이가 있었다. 그러나 순위 변수 함수(the parameters of scoring function)들이 실험 결과의 피드백에 의해 최적화됨에 따라 개선된 순위 함수(scoring function)는 또 다른 후보 서열(sequence)을 예측했고, 우리는 두 번째 실험과 세 번째 실험에서 기질에 대해 기존의 하이단토이네이즈보다 각각 4.5배, 5.3배 높은 활성을 갖는 하이단토이네이즈를 만들어냈다. 하이단토인과 하드록시하이단토인을 구별하는 특이성의 관점에서는 그 개선 정도가 기존의 하이단토이네이즈 보다 각각 41배, 135배 높았다. 컴퓨터를 이용한 모델링(computational modeling)을 이용해서 설계된 변종 하이단토이네이즈의 합리적인 활성 분석을 통해서 우리는 하이단토이네이즈의 활성 부위의 63번째와 159번째 위치가 아미노산 길이에서 상보성(complementarity)을 가진다는 것을 발견했다. 가장 높은 활성을 갖는 변종들을 제외하면 다른 변종들은 63번째 아미노산 위치의 곁사슬의 길이가 짧아지거나 가장 높은 변종의 곁사슬의 길이보다 길어지거나 짧아 짐에 따라 감소하는 경향을 보여주였다.
