Novel amphiphilic graft copolymers composed of poly(2-hydroxyethyl aspartamide) (PHEA) as the hydrophilic backbone and oligo(L-leucine) as the grafted hydrophobic chain were successfully synthesized by a ring-opening polymerization of the Leu-NCA to backbone polymer. The molecular structure of PHEA-g-OLleu, i.e. DS(Degree of substitution), and DP(degree of polymerization) was determined with the peak intensity in $^1H-NMR$ spectra and the weight percentage of the element in EA(elemental analysis). The DS is the mole percentage of the grafting unit with oligo(L-leucin) per total succinimide unit. DS can be controlled by grafting of ethylenediamine onto the PHEA backbone to prepare various macroinitiator, $PHEA-NH_2$. The PD is the degree of polymerization of oligo(L-leucine) onto PHEA backbone polymer. Resulting copolymers were characterized by various analytical techniques including differential scanning calorimeter, thermogravimetric analysis and X-ray diffractometry. These results obtained could prove that the spatial confinement of the oligo(L-leucine) grafts facilitated the crystallization of oligo(L-leucine) domains with neighboring oligo(L-leucine) in the PHEA backbone. The amphiphilic graft copolymer formed nano-sized self-assemblies with unique morphology in aqueous solution. The hydrophobic domains can adopt regular conformations that are insoluble in water, namely, rod-like α-helices for oligo(L-leucine). The unique self-assemblies in aqueous solution as the degree of substitution (DS) were observed with dynamic light scattering (DLS), fluorescence spectroscopy, circular dichroism (CD), transmission electron microscopy (TEM), Langmuir Blodgett (LB), and small angle neutron scattering (SANS) measurements. At the high DS, backbone PHEA could not form easily the loop and then another structure would be formed. Appropriate looping units of hydrophilic backbone polymer and curvature, K are essential factors to form the stable self-assembled aggregates. Also, a macrodipole moment of the α-helical block group would play a key role in assembling the structural elements by protein-like packing arrangement.
The novel immobilization technique using a poly(amino acid) multilayer was designed for the SPR sensing platform. These poly(amino acid) multilayers were confirmed as a relatively hydrophilic surface with little tendency for nonspecific adsorption of biomolecules and a flat surface that the biomolecular interactions can occur uniformly on the sensing surface. The poly(amino acid) multilayer functionalized with biotin was investigated to control the surface density and to estimate the optimum space between ligands for effective SPR sensing. This multilayer study demonstrates the importance of surface density which is significantly sensitive for fabrication of surface functional group in the monitoring of kinetic phenomena.
Bicyclic peptides with an Arg-Gly-Asp (RGD) motif have a high affinity for integrins $(for instance, \alpha_v\beta_3)$ overexpressed on angiogenic endothelial cells. We have developed the self-assembled nanoparticle of poly(amino acid)s grafted with oligo(L-leucine) in aqueous solution. A targeting element consisting of bicyclic RGD-4C peptide is also attached on the PHEA. The RGD-4Cs with the 1-4; 2-3 and 1-3; 2-4 disulfide bond arrangement were used for the coupling NPs. By coupling these peptides to nanoparticles (NPs), these NPs can serve as a site-specific drug delivery system to tumor endothelial cells in order to inhibit angiogenesis and tumor vasculature destruction and to tumor cells for binding and internalization. Also, the transmembrane receptors, integrin $α_vβ_3$ were incorporated into a lipid bilayer by vesicle spreading to monitor the binding mechanism of NPs by Surface Plasmon Resonance. These studies provide new insight into the ligand recognition specificity of integrins.
Ribozymes (Rzs) are catalytically competent RNAs that can be used to reduce expression of a pathogenic gene by binding and cleaving specific regions of target RNA with endoribonuclease activity. After transcription of a gene in the nucleus, the mRNA transcript is transported to the ribosome, which translates the mRNA into proteins. Rzs inhibit gene expression by blocking the translation of mRNA into proteins. PEG-b-poly(amino acid)s block copolymers were successfully synthesized for Rz delivery. PEG-b-Poly(L-lysine) copolymer formed nanoparticles with Rz through the electrostatic force between PLL segments and nucleic acids. Also, PEG-b-Poly(L-lysine) protected Rzs from RNase in biological fluids by forming complex nanoparticles.
양친성 폴리아미노산을 이용하여 수용액상에서 자기조립 현상에 의한 나노입자를 제조하고 이를 항암 전달체로 응용 연구하였다. 폴리아미노산 중 2차 구조인 α-helix 를 갖는 oligo(L-leucine)이 접목된 양친성 폴리아미노산 공중합체를 합성하여 α-helix 의 접목 치환도가 수용액상에서 나노전달체의 구조에 미치는 영향을 분석하였다. 본 연구에서는 폴리아미노산을 이용하여 제조한 나노입자의 암세포로의 전달을 증가시키기 위해 입자 표면을 암세포 부착 특이성을 갖는 펩타이드(RGD 펩타이드)로 수식하고, 다양한 암세포로의 전달과 메커니즘에 대한 연구를 수행하였으며, Surface Plasmon Resonance (SPR)를 이용하여 입자와 세포표면과의 상호작용에 대하여 연구하였다.
축중합에 의하여 합성된 폴리머 전구체인 poly(succinimide)를 제조하고, ethanolamine으로 개환하여 폴리아미노산 유도체인 친수성 poly(2-hydroxyehtyl aspartamide) (PHEA)를 합성하였다. Macroinitiator인 $PHEA-NH_2$ 를 이용하여 L-leucine NCA 단량체로 개환 중합하여 PHEA-g-oligo(L-leucine) 공중합체를 합성하였다. oligo(L-leucine)의 접목 치환도(DS)는 $PHEA-NH_2$ 의 도입된 아민의 양을 통해 조절하였고, oligo(L-leucine)의 중합도(PD)는 반응시 L-leucine NCA 단량체의 양을 통하여 조절할 수 있었다. 그라프트 공중합체는 수용액상에서 ‘precipitation and dialysis’ 법으로 자기조립 현상을 유도해 나노입자로 제조하였으며, 나노입자는 oligo(L-leucine)의 α-helix가 결집되어 형성된 소수성 도메인과 친수성 PHEA 사슬로 구성되었다. 소수성 분자단의 접목도를 조절함으로써 나노입자의 크기와 형태를 제어할 수 있었다. 접목도에 따른 나노입자의 구조적 특이성과 물리화학적 특성을 다양한 분석 장치를 통하여 확인하였다. 접목도가 낮은 경우에는 친수성 백본 폴리머인 PHEA의 사슬 중 고리를 형성하는 부분이 충분하여 쉽게 코어-셀 타입의 구형의 나노입자가 형성되었다. 접목도가 증가할수록 고리를 형성하는 부분이 충분하지 않게 되며 이로인해 PHEA의 rigidity가 증가하여 구형의 나노입자가 아닌 실린더 또는 베지클 타입의 자기조립체가 형성되었다.
제조한 나노입자에 암세포 부착 특이성을 갖는 펩타이드를 표면 수식하여 표적 지향성을 갖는 항암 전달체를 제조하였다. 백본 폴리머의 친수성 고리에 펩타이드를 표면 수식하기 위해 나노입자는 소수성 분자단이 낮은 접목도를 갖도록 조절하였다. 동일한 RGD 시컨스를 갖지만 구조가 다른 두 종류(1-4; 2-3 폼과 1-3; 2-4 폼)의 펩타이드를 합성하였다. 펩타이드가 수식된 나노입자의 암 혈관 세포와 암세포로의 전달을 확연히 증가시켰으며, confocal laser scanning microscopy와 flow cytometry, surface plasmon resonance를 이용하여 분석하였다. 다른 구조를 갖는 펩타이드의 암세포 부착 능력의 차이는 association 보다는 dissociation의 영향을 많이 받는 것을 확인하였다. 나노입자는 암 혈관 세포에는 과도하게 바인딩하며 암세포에는 그 농도를 조절함으로써 receptor-mediated enocytosis를 통해 세포내로의 전달이 이루어졌다. Surface Plasmon Resonance (SPR)을 이용하여 상호작용 정도를 실시간으로 모니터링하였다. 바인딩 정도뿐 아니라 association 과 dissociation의 kinetic phenomena를 정확하게 관찰하기 위해서는 센싱 표면의 리간드 개수를 조절해야 하며, poly(aspartic acid)-g-biotin 시스템의 경우 접목도가 6.2와 18.4 사이 값을 갖을 때가 최적 표면 개수(optimum surface density)임을 확인하였다.
라이보자임(ribozyme)은 특정 RNA를 선택적으로 절단하여 병원성 유전자와 단백질의 발현을 줄이는 능력을 갖는 RNA다. 폴리아미노산을 이용하여 라이보자임을 효과적으로 봉입하고 전달할 수 있는 나노입자를 제조하였고, 라이보자임의 안정화와 효과적인 전달에 적합한 전달체임을 확인하였다.
