Protein microarray has so many advantages for the high-throughput analysis of protein. In contrast to conventional protein analysis methods, only minute amounts of sample is required, little bias toward protein’s property is exist and multiplex analysis is possible in the analysis with protein microarray. In this work, three kinds of protein microarrays were developed. Firstly antibody microarray composed of 30 antibodies was constructed. These antibodies were developed in rabbit against proteins related with amino acid biosynthetic pathway of Escherichia coli. Several critical factors affected to performance of the antibody microarray were investigated and of them, cross-reactivity of antibody was found to manly cause the deviations of result from antibody microarray. With correction factors to offset the deviations and two color fluorescence assay, protein expression level of L-threonine-overproducing mutant (TF5015) was compared with that of wild-type (W3110). In TF5015, ten proteins were identified as up-regulated proteins and one was as down-regulated protein. This profiling result was validated with conventional analysis tool, western blotting and two-dimensional gel electrophoresis. Next allergen microarray was developed to diagnose the allergy. The major symptom of allergy is the elevation of allergen-specific IgE concentration in serum. Thus this allergen microarray was used to detect IgE expression level in patients’ sera for diagnosing. Extracts of two mites were used as model allergens and spotted onto glass slide. Subsequent binding of biotinylated anti-human IgE and streptavidin-Cy3 was employed as a fluorescence-producing method.
To get precise and reproducible results, some analysis factors were optimized, and under optimized conditions, 43 human sera were profiled. Profiling results were compared with conventional allergy diagnosis method, CAP system assay, and showed improved reproducibility and reliability compared with previous reported result. Finally, lung cancer is the most-increased and major cause in cancer-related death in Korea and USA, and 5-year survival rate is so much low due to difficult early diagnosis. So, to find biomarker of lung cancer, antibody microarray was fabricated with 24 antibodies against human proteins. Most mRNAs of these proteins were identified as differently expressed mRNA in lung cancer patients’ tissue in previous study. However because mRNA expression level shows low correlation with protein expression level and test with tissue give patient a pain, identification of proteins in serum as disease biomarker is required. By using 39 human sera as tested samples, internally normalized ratio (INR) as analysis method and pooled serum composed of normal persons’ sera as reference sample, six proteins were found as differential expressed protein in lung cancer patients’ sera through t-test. Some of them were validated through the western blotting. Hierarchical clustering with relative expression level of these proteins classified lung cancer patients from the others; the healthy, benign lung disease patients and lymphoma patients. Thus identified six proteins can be used as protein biomarkers for early diagnosis of lung cancer.
단백질 마이크로어레이는 단백질을 high-throughput으로 분석하기에 적합한 많은 장점들을 가지고 있다. 종래의 다른 단백질 분석법들과는 달리 아주 적은 양의 시료만 있어도 분석이 가능하며, 단백질 각각의 특성에 따른 편향된 결과가 많이 나타나지 않고, 한꺼번에 여러 개의 시료를 분석할 수도 있다. 이 연구에서는 세가지 종류의 단백질 마이크로어레이를 개발하였다. 먼저 30개의 항체로 이뤄진 항체 마이크로어레이를 만들었다.
이 항체들은 대장균의 아미노산 생합성 경로에 관련이 있는 단백질을 항원으로 갖는 것으로, 토끼의 면역작용을 이용하여 만들었다. 항체 마이크로어레이에서 얻은 단백질의 상대적인 양 분석의 실험 결과가 실제의 결과와 다르게 나와, 우선 항체 마이크로어레이의 결과 도출에 영향을 줄 수 있는 여러 가지 요인들을 분석해 보았는데, 그 결과 항체의 cross-reactivity가 결과가 왜곡되는 데에 가장 크게 영향을 주는 것으로 나타났다. 실험 결과의 왜곡을 보정하기 위한 correction factor와 두 가지 종류의 염료를 사용한 검출 방법을 이용하여 L-threonine 과다생산균주 (TF5015)의 단백질 발현량을 원균주 W3110과 비교 분석한 결과, 10개의 단백질이 상대적으로 많이, 1개의 단백질이 적게 발현되었음을 확인하였으며, 이 결과를 western blotting과 2-DE를 통하여 재차 확인하였다. 다음으로는, 알레르기를 진단하는 데 사용할 수 있는 알러젠 마이크로어레이를 개발하였다. 알레르기의 가장 큰 증상은 혈액 내에서 해당 알러젠에 대한 IgE의 발현량이 증가하는 것이므로, 알러젠 마이크로어레이는 진단을 위하여 환자의 혈청 내에 있는 IgE의 발현량을 검출하는 방식을 채택했다. 두 종류의 진드기 추출물을 대표로 사용하여 유리 기판 위에 spotting하였고, biotinylated anti-human IgE과 streptavidin-Cy3의 연속 결합을 통하여 신호를 검출하였다. 정확하고 재현성 높은 진단 결과를 얻기 위해 분석 방법을 최적화하였고, 이러한 최적 조건에서 43명의 혈청을 검사했다. 이 결과를 종래의 진단 방법 및 다른 알러젠 마이크로어레이의 결과와 비교하였으며, 향상된 재현성과 정확성을 보여주는 것으로 나타났다. 마지막으로, 폐암을 진단하기 위한 항체 마이크로어레이를 만들었다. 폐암은 미국과 한국에서 암 관련 사망 원인 중 가장 많은 부분을 차지할 뿐만 아니라 가장 빨리 증가하는 원인이기도 하다. 또한 조기 진단의 어려움 때문에 5년 생존율이 아주 낮은데, 이를 극복하기 위해 폐암의 질병표지자를 찾는 것이 필수이다. 이 항체 마이크로어레이에는 24 종류의 항체를 포함시켰는데, 이들 중 대부분은 선행 연구에서 폐암 환자의 조직 내 mRNA 발현량이 정상인과 많이 다르다고 확인한 것들을 항원으로 삼고 있다. 조직을 이용하여 병을 진단하는 것은 환자에게 고통을 줄 뿐 아니라, mRNA 발현량이 단백질의 발현량과 낮은 상관 관계를 가지고 있으므로, 질병표지자로서 혈청 내의 단백질을 확인하는 것이 필요한 것이다. 39명으로부터 얻은 혈청을 건강인의 혈청에 대하여 internally normalized ratio (INR)이라는 방법으로 얻은 결과를 t-test로 분석하여, 여섯 개의 단백질이 폐암 환자의 혈청 내에서 건강인과는 다른 발현 양상을 보인다는 것을 확인하였고, 이들 중 일부를 western blotting으로 재확인하였다. 이 단백질들의 발현 양상을 이용한 hierarchical clustering에서 폐암 환자들은 건강인, 양성 종양 환자, 임파종 환자들과 뚜렷하게 구별되는 양상을 보여주었다. 따라서 이 여섯 개의 단백질들은 폐암의 조기 진단을 위한 질병표지자로서 활용할 수 있을 것이다.
