The ABC transporter apparatus of the Gram-negative bacterial type I secretion pathway has been used to secrete many recombinant proteins. The ABC transporter (TliDEF) from Pseudomonas fluorescens SIK W1 mediated the secretion of a thermostable lipase (TliA). To increase the secretion level of TliA, we firstly optimized the expression level and expression timing of tliA and tliDEF. The four types of co-expression systems for tliA and tliDEF were constructed. When the relative expression levels were changed by adding different concentrations of IPTG, the secretion (16.9 U/ml) of TliA in E. coli [pTliDEFA-223 + pACYC184] was significantly higher than E. coli [pKK223-3 + pTliDEFA-184] secreting the lowest level of TliA (5.2 U/ml). The secretion level of TliA of E. coli [pTliDEFA-223 + pACYC184] was achieved to 26.4 U/ml by inducing gene expression at culture initiation time. Secondly, The ABC transporter (TliDEF) was engineered using directed evolution (error-prone PCR) to improve its secretion efficiency for TliA. TliD mutants with increased secretion efficiency were identified by co-expressing the mutated tliD library with the wild-type tliA in E. coli, and by screening the library with a tributyrin-emulsified indicator plate assay and a microtiter plate-based assay. Four selected mutants from one round of error-prone PCR mutagenesis, T6, T8, T24 and T35, showed 3.2- (36.4 U/ml), 2.6- (29.2 U/ml), 2.9- (32.8 U/ml) and 3.0-fold (34.0 U/ml) increases of the secretion level of TliA, respectively, but had almost the same expression level of TliD in membrane as that of the wild-type TliDEF transporter. These results indicated that the improved secretion of TliA was mediated by these transporter mutations. Each mutant had a single amino acid change within the predicted cytoplasmic regions in the membrane domain of TliD, implying that the corresponding region of TliD was important for the improved and successful secretion of target protein. Finally, we tried to produce TliA in recombinant P. fluorescens SIK W1. The secretion level (1015.6 U/ml) of TliA in P. fluorescens [pTliDEFA-519] was much higher than that (2.5 U/ml) of TliA in E. coli [pTliDEFA-519]. When the optimization of culture condition for the production TliA was performed using P. fluorescens [pTliDEFA-519] in a flask culture, the optimization culture condition was determined to the cultivation temperature of 25℃ and the medium aeration conditions (60 ml of medium in 250-ml flask at 250 rpm). The optimized medium condition was determined to be 10 g/l of dextrin, 40 g/l of Tween-80 and 30 g/l of peptone. At optimized culture condition, the lipase production level was 2204.7 U/ml. To more increase the production of TliA, batch fermentation of the recombinant P. fluorescens was performed at optimized culture condition in 2.5-l fermentor. The lipase production was achieved at a high level of 8452.3 U/ml.
그람 음성 세균의 type I 분비경로인 ABC transporter는 많은 재조합 단백질의 분비생산에 이용되고 있다. Pseudomonas fluorescens SIK W1에서 유래한 ABC transporter인 TliDEF transporter는 내열성 리파제인 TliA를 세포 외부로 분비하였다. TliA의 분비생산량을 증가시키기 위해, 먼저 tliA와 tliDEF의 발현량과 발현시기를 최적화 하였다. 그러기 위해서, 네 종류의 tliA와 tliDEF의 공발현 시스템을 제작하였다. 도입되는 IPTG의 농도를 달리하여 상대적 발현량을 변화시켰을 때, E. coli [pTliDEFA-223 + pACYC184]가 가장 낮은 분비량 (5.2 U/ml)을 나타내는 E. coli [pKK223-3 + pTliDEFA-184]에 비해 상당히 높은 TliA 분비량 (16.9 U/ml)을 보였다. 또한 E. coli [pTliDEFA-223 + pACYC184]은 배양 시작시간에 유전자 발현을 유도 시, 그 분비량이 26.4 U/ml에 이르렀다. 다음으로, TliA에 대한 TliDEF transporter의 분비효율을 증가시키기 위해 방향성 진화 방법 (directed evolution)을 이용하였다. 분비효율이 증진된 TliD 변이체들은 E. coli에서 야생형 tliA와 변이된 tliD library와 함께 발현 시킨 후, tributyrin-emulsified indicator plate assay와 microtiter plate-based assay를 이용하여 선별하였다. 첫번째 round error-prone PCR mutagenesis의 수행 후 선별된 4개의 변이체인 T6, T8, T24, T35의 경우, 각각 3.2배 (36.4 U/ml), 2.6배 (29.2 U/ml), 2.9배 (32.8 U/ml), 3.0배 (34.0 U/ml)의 TliA 분비량의 증가를 나타내었다. 그러나 이 변이체들은 세포막에서 야생형 TliDEF transporter의 TliD 발현량과 거의 동일한 TliD 발현량을 나타내었다. 위 결과들은 TliD 변이체들의 TliA에 대한 증진된 분비능력은 transporter들의 변이에 의한 것임을 보여준다. 각 변이체들은 TliD의 membrane domain의 predicted cytoplasmic region 내에서 하나의 아미노산 변화를 나타내었고, 이 TliD에 해당되는 부분이 목적 단백질의 증진된 분비능력에 중요한 역할을 함을 의미한다. 마지막으로, P. fluorescens SIK W1에서 TliA의 생산을 시도하였다. P. fluorescens [pTliDEFA-519]의 경우, E. coli [pTliDEFA-519]의 TliA 분비량 (2.5 U/ml)에 비해 매우 높은 양의 TliA 분비량 (1015.6 U/ml)을 나타냈다. TliA의 대량생산을 위해 플라스크에서 P. fluorescens [pTliDEFA-519]의 배양 조건을 최적화했을 때, 최적 배양온도는 25℃, 최적 aeration 조건은 medium aeration 조건 (250 ml 플라스크에서 60 ml 배양액, 250 rpm의 교반속도)이었다. 최적 배양액 조건은 10 g/l의 dextrin, 40 g/l의 Tween-80, 30 g/l의 peptone으로 결정되었다. 최적화된 배양조건에서 2204.7 U/ml의 TliA 분비량을 나타내었다. TliA 생산량을 더 증가시키기 위해, 플라스크에서 확립된 최적화된 배양 조건에서, 재조합 P. fluorescens의 batch fermentation을 2.5 l fermentor에서 수행하였다. 그 결과 최대 8452.3 U/ml의 TliA 생산이 이뤄졌다.
