Diverse functions of proteins have been evolved through the complex gene arrangement and further fine-tuning processes for a long time period. It is thought that these processes are accomplished by reusing or retaining limited protein progenitor scaffold. As a result, proteins having distinctly different physiological functions share the same structural scaffold and these are grouped into the superfamily enzymes. Though superfamily enzymes have the low sequence similarity, they share the similar protein scaffold and catalytic mechanism. Cyclic amidohydrolases and penicillin binding proteins/β-lactamases are typical superfamily enzymes. The evolutionary relationship and common properties of superfamily proteins give the hint to the design of proteins with desired functions. In this experiment, new catalytic activity was designed and evolved from existing protein scaffold based on this information about superfamily enzymes. Target enzymes were TEM-1 β-lactamase and penicillin binding protein 5 having similar mechanistic and structural properties. To create β-lactamase activity from penicillin binding protein scaffold, the combinatorial approach of SIAFE and directed evolution was carried out. By using SIAFE approach, the functional elements for enhancing of substrate binding and introducing catalytic residues were incorporated into PBP5 scaffold in a random and combinatorial way. It was further optimized through three rounds of directed evolution by mimicking the natural protein evolution. Through in vitro evolutionary processes, finally evTEM variant having β-lactamase activity was found. It has biased 36 amino acids mutations throughout the entire gene segment, mostly in the substituted loop regions as expected. The designed and incorporated functional elements were conserved during the extensive evolutionary processes and essential for evTEM to hydrolyze cefotaxime. Though its structural instability, evTEM showed distinct in vivo and in vitro β-lactamase activity. These results suggest that β-lactamases were evolved from PBP scaffold in nature, and the combinatorial approach of SIAFE and directed evolution is efficient method for generating new catalytic activity from existing protein scaffold.
생체 내에서 다양한 기능을 수행하는 단백질들은 오랜 시간의 진화 과정 동안 복잡한 유전자의 재조합과 후 조정 과정을 거쳐서 현재와 같은 다양한 형태로 진화되어 왔다. 단백질의 진화 과정에 있어 새로운 기능의 창출은 기존의 한정된 단백질 골격을 다시 사용하거나 유지함으로써 이루어졌을 것으로 생각된다. 그 결과로써 생체 내에서 전혀 다른 생리학적 기능을 수행하는 단백질들의 경우에도 구조를 유지하는 기본적인 단백질 골격은 유사하며, 이들 단백질들은 슈퍼 패밀리 효소로 불린다. 이들 슈퍼 패밀리 효소들은 매우 낮은 아미노산 서열 유사성을 가지지만, 비슷한 단백질 골격과 촉매 기작을 공유한다. 사이클릭 아미도 하이드로라제와 페니실린 결합 단백질/베타 락타마제는 대표적인 슈퍼 패밀리 효소들로, 이들의 진화론적 관계 및 공통적인 구조적, 반응 기작적 특징들은 원하는 기능을 지닌 신기능 단백질의 설계에 결정적인 힌트를 제공한다. 본 연구에서는 이러한 슈퍼 패밀리 효소들의 특성에 대한 구조적 반응 기작적 정보를 바탕으로 기존의 단백질 골격을 이용하여 새로운 촉매 기능을 설계하고 진화시켰다. 대상 단백질은 기질에 대해서 비슷한 반응 기작을 보이고 공통적인 구조적 특성을 가지는 TEM-1 베타 락타마제와 페니실린 결합 단백질-5였다. 페니실린 결합 단백질의 골격으로부터 새로운 기능인 베타 락타마제의 기능을 창출하기 위해서 SIAFE와 방향적 진화기법의 조합적 방법이 시도되었다. SIAFE의 과정을 통해서 기질과의 결합 정도를 증가시키고 촉매 기능에 필수적인 기능적 요소들을 무작위적, 조합적으로 PCR을 이용한 유전자 재조합 과정을 통해 페니실린 결합 단백질-5의 골격에 삽입시켰다. 이는 다시 자연상의 단백질 진화 과정을 모방하여 무작위적 아미노산의 돌연변이를 유발시키는 방향적 진화의 세 단계를 거쳐서 그 기능이 더욱 향상되고 조정되었다. 이러한 생체 외에서의 인위적 진화 과정을 통해서 최종적으로 새로운 베타락타마제 기능을 가지는 변이체를 얻었다. 이 변이체는 전체 유전자 서열에서 36 개의 아미노산 돌연변이를 가지고 있었다. 대부분의 아미노산 변화는 새로운 촉매 활성을 위해 삽입된 기능적 요소들에서 이루어졌다.
또한, 설계 삽입된 기능적 요소들은 급격한 돌연변이의 발생에도 불구하고 보존되었으며, 이들은 새로운 기능인 베타락탐 항생제인 cefotaxime을 가수 분해하는데 필수적인 요소들이었다. 비록, 변이체가 구조적으로 불안정성을 보이지만 생체 내 그리고 생체 외에서 베타 락타마제의 활성을 보임을 확인하였다. 이러한 결과는 실제 자연상에서도 서로 상호활성이 존재하지 않는 페니실린 결합단백질의 골격으로부터 베타락타마제의 기능이 진화되었다는 사실을 설명해준다. 또한, SIAFE 기법과 방향적 진화 방법의 복합적 접근 방식은 기존의 단백질 골격을 이용해 새로운 촉매 기능을 창출하는데 효과적인 방법이라는 사실을 설명해준다.
