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Screening of small molecule modulators of the p53 pathway with BioMAGIC = BioMAGIC을 이용한 p53 Pathway의 저분자 화합물 조절인자의 Screening에 대한 연구
서명 / 저자 Screening of small molecule modulators of the p53 pathway with BioMAGIC = BioMAGIC을 이용한 p53 Pathway의 저분자 화합물 조절인자의 Screening에 대한 연구 / Tae-Uk Kim.
저자명 Kim, Tae-Uk ; 김태욱
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2006].
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초록정보

It is important to screen bioactive compounds including drugs inside living human cells under physiologically and pharmacologically relevant contexts. BioMAGIC can be used to monitor protein-protein interactions as well as small molecule-protein interactions. In this study, I examined whether BioMAGIC can be used to screen small molecule modulators of specific protein-protein interaction such as p53-MDM2 interaction in vivo inside living cells. One of the most potent small molecule inhibitors identified in this screen was CGK360. Treatment with CGK360 markedly reduced the magnetic field-directed translocation of $EGFP-p53^*$ in both RKO and U2OS cells. To examine how CGK360 inhibits p53-MDM2 interaction, we examined the effect of CGK360 on p53 and MDM2 protein levels by immunoblotting. Incubation of RKO cells with CGK360 led to increase in the levels of p53 and its target proteins including MDM2 and $p21^{Waf/Cip1}$. These results raise a possibility that p53 accumulates in cells treated with CGK360, thus leading to an elevation in the levels of MDM2 and $p21^{Waf/Cip1}$ in a manner consistent with activation of th p53 pathway. To address this possibility, I analyzed the subcellular localization fo p53 in RKO cells after treatment with CGK360. Treatment with CGK360 resulted in the dramatic accumulation of p53 protein inside of nucleus. To confirm the p53 activation by CGK360, I measured the DNA binding activity and phosphorylation of p53 after treatment with CGK360. The p53 DNA binding activity was assessed by an electrophoretic mobility shift assay. Treatment with CGK360 sharply induced the formation of p53-DNA complex. Immunoblotting showed that CGK360 induced the phosphorylation of p53 on serine residue Ser15, an event which is critical to the process of p53 activation. All of these results consistent with the idea that CGK360 is an activator of the p53 pathway. CGK360 is flat, which may allow it to intercalate between the stacking bases of DNA. This flat structure is like camptothecin, which targets the DNA-topoisomerase I complex. To examine whether topoisomerase is a molecular target of CGK360, I analyzed the potential of CGK360 to inhibit the activities of topoisomerase I and II in vitro. Topoisomerase II activity was measured based upon the decatenation of kinetoplast DNA. Topoisomerase I activity was determined by the accumulation of nicked DNA from supercoiled substrate DNA. Nicked circular DNA accumulated with the addition of CGK360. The CGK360-induced nicking activity required DNA topoisomerase I, since nicked DNA was not accumulated in its absence. These results suggest that CGK360 may affect genotoxic response through stabilizing the complex of topoisomerase I and nicked DNA, thereby activating p53.

p53 단백질은 50% 이상의 암에서 돌연변이 되어 있으며, 암세포에서 정상적인 기능을 수행하지 못한다. p53 단백질의 기능을 되돌려 암세포를 파괴하는 방법이 연구 되고 있으며, 이에 따라 p53 pathway의 활성을 찾게 하는 방법으로 p53-MDM2의 상호작용을 방해하는 저분자 물질을 찾는 것이 주목을 받고 있다. 이 연구에서는 p53-MDM2 상호작용 저해제를 BioMAGIC으로 screening 하였다. BioMAGIC은 MAGIC과 이론적인 기반을 같이하는 새로운 기술로, 자성을 갖는 나노입자 대신 자성에 반응하는 생체 단백질인 ferritin을 이용하여 살아있는 세포 내에서 실 시간으로 단백질 간의 상호작용이나 단백질과 저분자 물질 간의 상호작용을 탐지하는 기술이다. BioMAGIC이 단백질과 저분자 물질 간의 상호작용을 탐지할 수 있다는 것을 rapamycin이 매개하는 FKBP-FRB의 상호작용을 탐지하는 것으로 보인 후 p53-MDM2의 저해제를 screening 하였다. BioMAGIC screening을 통해 CGK360은 p53-MDM2 상호작용을 저해하는 것으로 나타났다. p53-MDM2 상호작용이 CGK360의 직접적인 상호작용 저해에 의한 것인지,p53 pathway가 활성을 띄어 저해되는 것인지 확인하기 위해,p53 pathway 관련 단백질인 MDM2와 p21의 immunoblotting을 수행하였다.p53, MDM2와 p21가 CGK360을 처리함에 따라 증가하는 것을 확인하였고,p53 자체도 인산화 되거나 핵으로 이동하였다. 이에 따라 CGK360은 p53-MDM2 상호작용의 직접적인 저해제라기 보다 p53 pathway을 활성화 시킬 것이라고 예측하였다. CGK360이 topoismoerase I 저해제인 camptothecin과 유사하게 생겼으므로, topoisomerase I 혹은 II의 저해제일 것으로 생각하고 두 단백질의 활성을 측정한 결과 CGK360은 topoisomerase I의 저해제로 밝혀졌다. CGK360이 직접 DNA에 끊김을 유도하는 것이 아니라 topoisomerase I과 DNA의 결합을 안정화 시켜 DNA의 손상으로 인한 p53의 활성을 유도하는 것으로 보인다.

서지기타정보

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청구기호 {MBS 06013
형태사항 v, 34 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 김태욱
지도교수의 영문표기 : Tae-Kook Kim
지도교수의 한글표기 : 김태국
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 Reference : p. 28-31
주제 BioMAGIC
p53
small molecule
in vivo
screening
저분자 화합물
스크리닝
바이오매직
세포 내
상호작용
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