Enzymes are versatile biocatalysts and find increasing applications in various industrial processes including organic synthesis and bioremediation. However, the application of enzymes is often limited by the short catalytic lifetime and by the difficulty in recovery and recycling. Recent breakthroughs in nanotechnology provide more diverse materials and approaches to solve these problems. In this study, different types of nanostructured materials were used as hosts for enzyme immobilization since they provided a large surface area, leading to a higher volumetric enzyme activity. Crowding effect of enzyme molecules in confined spaces was investigated using entrapped enzymes in mesoporous silica. Magnetically separable and highly stable enzyme-palladium nanocomposites were developed for further application into dynamic kinetic resolution.
With two different model enzymes, α-chymotrypsin (CT) and lipase (LP), crosslinked enzyme aggregates (CLEAs) were developed in hierarchically-ordered mesocellular mesoporous silica (HMMS) for effective enzyme entrapment and stabilization. The immobilization was achieved by the enzyme adsorption followed by glutaraldehyde (GA) crosslinking. This resulted in the formation of nanometer scale CLEAs entrapped in the mesocellular pores of HMMS (37 nm), which did not leach out of HMMS through narrow mesoporous channels (13 nm). Using this ship-in-a-bottle approach, high loading capacity and greatly improved stability were achieved mainly due to the prevention of enzyme leaching and autolysis. CLEA in one-dimensional bent pores of SBA-15 mesoporous silica did not also leach out. Highly loaded CLEAs in SBA-15 are so stable that the initial enzyme activity was maintained without any loss under rigorous shaking for more than two weeks. Silica nanoparticles prepared by St$\ddot{o}$ber method were utilized for covalent immobilization of lipase. Glycidyl methacrylate (GMA) and ethylene diamine (EDA) were incorporated onto the surface of the nanoparticles and a coupling agent such as glutaraldehyde (GA) or 1,4 phenylene diisothiocynate (NCS) was used for covalent attachment. The relative activities of the lipases immobilized on EDA-GA and EDA-NCS attached silica nanoparticles were significantly high and almost in the same range with the free enzyme. Immobilized lipase retained high level of activity over a wide range of pH, and thermal stability was considerably enhanced by the immobilization.
Since the encapsulated enzymes in mesoporous silica could mimic the confined and crowded protein environment in a living cell, the crowding effect on thermal stability was investigated using model enzymes, α-chymotrypsin and glucose oxidase. The amount of enzyme loading in MSU-F mesoporous silica was controlled by varying specific concentration of enzyme solution. Highly-loaded enzymes in MSU-F silica were more stable than the samples entrapping lower amount of enzymes. This result suggests that more crowded environment enhances the thermal stability of enzymes.
Magnetically separable and highly stable enzyme-palladium nanocomposites were developed for further application into dynamic kinetic resolution. Candida antarctica lipase B (CALB) molecules, palladium nanoparticles, and magnetites were immobilized via CLEA approach. The resulting enzyme-metal nanocomposites showed a clear retention of activity with 30 times iterative reactions with magnet separation, and greatly improved stability in a harsh shaking condition for over two weeks. Immobilized palladium in the nanocomposites also provided excellent reactivity for both racemization of amines and reduction of oximes, hence the enzyme-metal nanocomposites had a potential to apply for enzyme-palladium coupled dynamic kinetic resolution.
This work demonstrates that different types of nanostructured materials were efficiently used as hosts for enzyme immobilization. The synergy between various nanostructures and suitable immobilization methods including CLEA resulted in vivid improvements of catalytic features, therefore it offers great potential to expand to any other enzymes for the development of stable system in many enzymatic applications.
효소는 기질의 다양성 및 특이성으로 인해 여러 가지 효소반응 및 유기반응에 널리 이용되는 생촉매이다. 효소를 산업적으로 응용하려 할 때 문제가 되는 점은 효소의 활성이 시간이 감에 따라 감소하는 낮은 안정성과, 재사용이 어려운 점이다. 최근 이 문제를 해결하기 위한 방법으로서 나노 재료에 효소를 고정화시키는 연구가 많이 진행되고 있다. 나노 재료는 기존 고정화 지지 물질에 비해 단위부피당 큰 표면적을 가지고 있어서, 보다 집적된 효소 고정화가 가능해 높은 활성을 유도할 수 있는 장점이 있다.
본 연구에서는 다양한 메조포로스 미디어에 chymotrypsin, lipase 등 다양한 효소를 CLEA (crosslinking enzyme aggregate) 방식으로 고정화해 효소를 집적시키고, 효소반응 중의 leaching 을 막음으로써, 효소 활성을 크게 안정화시켰다. 두 가지 기공 크기를 가지고 있는 메조포로스 실리카 혹은 한 가지 크기의 채널형의 기공을 가지고 있는 SBA-15 실리카를 대상으로 CLEA를 만든 결과 기존의 공유 결합법 혹은 물리 흡착법에 비해 획기적으로 큰 효소 로딩 양과 shaking 조건에서의 획기적인 안정성을 얻을 수 있었다. Autolysis 작용을 하는 효소를 CLEA 방식으로 고정화할 경우 효소 스스로 활성을 잃는 영향이 감소함을 발견하였다. 실리카 나노파티클은 다양한 화학적 공유결합을 이용해서 Lipase를 고정화하는 지지물질로서 사용하였는데, Amine 작용기를 붙인 실리카에 적절한 공유결합 linker인 Glutaraldehyde 혹은 1,4 phenylene diisothiocynate를 이용해 고정화한 결과 Free enzyme 과 비슷한 specific activity를 얻을 정도로 효율적으로 고정화가 이루어졌으며 더 넓은 범위의 pH에 대해 안정된 효소활성과 향상된 열적 안정성을 얻을 수 있었다.
또한 메조포로스 실리카의 기공 안에 위치한 효소분자의 거동이 실제 생체 내에서의 단백질의 거동을 효과적으로 모사한다는 데 착안하여, 효소 분자의 밀집 정도가 효소분자의 Intrinsic thermal stability (본질적 열적 안정성) 에 미치는 영향 (crowding effect) 을 연구하였다. 생체 내의 단백질 분자는 제한된 공간 (Cell 내부) 안에 고농도로 존재하는데, 이의 거동을 실험하기 위해 실제 Solution 상에서 이와 비슷한 고농도의 단백질 용액을 만들게 되면, 엉기는 현상이 발생해 효과적으로 모사할 수 없게 된다. 적절한 크기의 Mesopore 안에 위치한 효소분자의 경우는 그 로딩 양을 적절히 조절함으로써 효소 분자의 Crowding 정도를 조절할 수 있으므로, 그 영향을 실험적으로 증명할 수 있다. 그 결과, 이론적인 모델링으로 예상된 것과 같이, 보다 많이 Crowding 되어 있는 경우 효소의 stability 가 증가하는 결과를 얻을 수 있었다.
메조포로스 카본 안에 CLEA 개념을 응용한 Multi-catalyst system 을 구현하였다. Candida antarctica lipase B (CALB) 효소를 유기 용매인 헥산에 anionic surfactant 를 사용한 Ion-paired method를 이용해 녹인 후 같은 종류의 용매인 헥산에 분산되어 있는 Magnetite nanoparticle, Palladium nanoparticle 과 같이 메조포로스 카본에 물리 흡착한 후, 수용액상에서 Glutaraldehyde를 사용하여 효소를 cross-linking 하는 방식으로 고정화시켰다. 그 결과 효소의 aggregate 안에 금속 촉매가 잡혀 빠져나오지 않는 결과를 얻었고, 자석을 이용해 30회 이상 활성을 유지하며 성공적으로 분리되는 결과를 얻었다. 강한 Shaking 조건에서 효소의 활성은 안정적으로 유지되었으며 Palladium의 활성 (Reduction & Racemization) 역시 큰 상태로 유지됨을 알 수 있었다.
