This paper describes a novel microfluidic cell culture platform for 3-dimensional cell patterning and in situ cell-based assays. The microfluidic device is fabricated by photolithography and poly(dimethylsiloxane) (PDMS) replica molding. The mixture of HepG2 cells and a sol-gel transition peptide hydrogel is hydrodynamically focused and patterned in the middle of the main channel of a microfluidic device. The cells are 3-dimensionally encapsulated and cultured on a microscope plate for over 2 days at the same time. A toxicant injected into one side inlet of a microfluidic device shows a linear concentration gradient profile at the entire area in the stripe-shaped micro-scaffold. The higher toxicant concentration gradient forms, the wider dead zone of cells in the peptide scaffold represents. This microfluidic platform facilitates in vivo-like 3-dimensional microenvironment, and provides credible cell-based screening and assays including cytotoxicity test, cell viability monitoring, continuous dose-response assay, drug-drug interaction and metabolism analysis. The device is also contributed to a novel biomimetic blood vessel platform for micro-angiological study by exchanging the mixture and media flows. Various geometries of vessel walls and blood flow in a biomimetic blood vessel model can be controlled by the media, distilled water and media flows in a microfluidic device.
본 연구에서는 생체를 모방한 미세 환경에서 삼차원으로 세포배양을 수행함과 동시에 다양한 세포기반 분석(cell-based assay)을 할 수 있는 새로운 플랫폼을 개발하였다. 세포기반 분석기술은 신약개발 과정에 있어서 매우 유용한 기술 중 하나로, 전 임상이전의 제2차 스크리닝 단계에 있어서 저분자 화합물 라이브러리의 발굴, 독성 판별 등을 수행함으로써 신약 타겟의 검증에 소요되는 비용과 시간을 절약할 수 있는 중요한 분석기법이다. 2차원 세포배양에서는 생체 안에서 일어나는 세포의 활성 및 기능이 떨어지지만 3차원 배양 시에는 그 기능들이 유지가 된다는 보고가 발표되면서, 최근 생체에 가까운 3차원 환경을 만들어줌으로써 세포기반 분석의 신빙성을 높이기 위한 노력이 활발히 진행되고 있다. 지금까지 3차원 배양을 위한 다양한 scaffold와 세포외형질(extracellular matrix)의 조합 및 개발로 물리적인 3차원 환경을 모사하는 세포배양 모델들은 많이 개발되었지만, 단순한 세포배양 수단 외에 신약개발에 직접 이용될 수 있는 3차원 세포기반 분석 시스템은 거의 연구가 이루어지지 않았다. 최근 미세유체기술(microfluidics)과 표면처리 기술을 이용한 2차원적 세포 패터닝 및 세포배양을 했던 기존 연구와는 달리, 마이크로채널 내에서 3차원적으로 세포를 배양하려는 시도가 이루어지고 있다. 몇몇 그룹에서 유체의 한쪽 벽면으로 세포를 3차원적으로 배양, 유전영동 힘 혹은 UV를 이용한 삼차원 패터닝 등을 시도했지만, 이런 방식으로는 분석기법의 적용이 매우 제한되는 단점과 세포 친화적이지 못한 방식이라는 점에서 한계를 지닌다.
본 연구에서는 sol-gel 상변이가 일어나는 peptide hydrogel을 마이크로채널 내에 흘려주어, 생체내의 환경과 더욱 가까운 3차원 미세환경을 조성함과 동시에 소량의 약물로 다양한 세포기반 분석이 가능한 시스템을 개발하고자 하였다. 채널 양쪽에서는 약물 주입에 의한 다양한 세포기반 분석이 이루어질 수 있도록 주 채널(main channel)의 중앙부분에 띠 모양으로 3차원 세포패터닝 (3-dimensional cell patterning)을 하여 HepG2 (Hepatocellular carcinoma cell line)를 배양하였다. 패터닝된 세포는 미세환경 내에서 2일 이상을 배양하였고 그 세포의 형태가 기존의 방식으로 키웠을 때 보다 더욱 종양의 특성을 나타냄을 알 수 있었다. 세포기반 분석 응용을 위한 일환으로, 주 채널의 중앙부분에 띠 모양으로 형성된 마이크로 형틀(micro-scaffold)내에서 어떻게 농도기울기가 형성되는지를 알아보기 위해서 fluorescein을 이용하여 살펴보았다. 그 결과, 형틀 내에서 직선상의 농도 기울기가 형성되었음을 알 수 있었고 이런 특성을 통하여 세포기반 독성실험에 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 농도에 따른 독성실험을 한 결과, 높은 농도의 Triton X-100을 주입할 수록 죽은 세포의 영역이 넓게 나타나는 것을 볼 수 있었다. 또한, 본 플랫폼을 이용하여 3차원 세포패터닝을 주 채널의 양 벽면쪽으로 함으로써 생체를 모방한 미세 혈관구조의 플랫폼으로써 제시할 수 있었다. 혈관벽에 해당하는 패터닝 두께는 유체속도를 조절함으로써 제어할 수 있었다.
본 연구의 결과는 마이크로채널 내에서 sol-gel 상변이를 일으키는 hydrogel과 미세유체기술을 이용해서 특별한 표면처리과정 없이 3차원 세포패터닝을 구현할 수 있다는 데 의의가 크다고 할 수 있다. 또한, 제작된 미세 세포배양 및 분석시스템은 생체내의 환경과 가까운 미세 환경을 제공해 줌과 동시에 양쪽 배지 주입구에 다양한 약물을 주입함으로써 세포독성, 약물간의 반응 및 대사물질, 등 다양한 세포기반 분석에 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 삼차원 동시배양 및 혈관학에 관련된 연구에도 이용될 수 있다. 향후, high contents imaging 및 automatic injection 기술을 함께 접목시킨다면 대량발굴탐색 (high-throughput screening)에도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
