This paper reports a novel immunoassay method using superparamagnetic nanoparticles and an enhanced magnetic field gradient in a microfluidic device. In this detection scheme, microbeads are deflected from their own pathway as much as analytes are conjugated with microbeads and superparamagnetic nanoparticles by sandwich immunoreactions. Since the deflection velocity of microbeads is proportional to the magnetic field gradient, lower detection limit can be controlled by the higher magnetic field gradient. In this study, a ferromagnetic microstructure connected with a permanent magnet is used to increase the magnetic field gradient $(~10^4 T m^{-1})$ in a microfluidic device. The microfluidic device with the microchannel is fabricated by poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molding process and bonded on the glass wafer with the electroplated Ni microstructure. We successfully apply this method to detect an allergen-specific IgE antibody in human serum. House dust mites, Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae, are used as the sources for allergen. For allergen-specific IgE detection, we use fluorescent polystyrene beads conjugated with two types of mite allergens, superparamagnetic nanoparticles conjugated with anti-human IgE, and mite-specific IgE antibodies. The detectable range of rabbit IgG is 200 pg $mL^{-1}$ to 1 pg $mL^{-1}$, and those of the mite-specific human IgE are 19.47 ng $mL^{-1}$ to 104 pg $mL^{-1}$ (D. pteronyssinus) and 10.68 ng $mL^{-1}$ to 151 pg $mL^{-1}$ (D. farinae), respectively. With this platform technology, the multiplexed immunoassay could be possible when the specific allergen proteins are immobilized with the fluorescently encoded microbeads.
본 연구에서는 단백질과 같은 생체 분자를 감지하기 위해 강화된 자기장 구배와 상자성 미세 입자를 이용한 미세 유체 기반의 면역 측정법을 개발하였다. 또한, 이러한 자기력을 이용한 미세 유체 기반의 면역 측정법을 인간 혈청에 있는 진드기 알레르겐 특이 항체 (IgE) 검출 시스템에 성공적으로 적용할 수 있었다. 이러한 측정 방법의 기본적인 원리는 면역 반응에 의해 형광 미세 입자에 붙게된 상자성 미세 입자로 인해 형광 미세 입자가 높은 자기장 구배로 편향되는 현상을 이용한 것이다. 따라서 편향되는 속도를 측정하게 되면 생체 분자의 농도를 정량화할 수 있게 된다. 즉, 생체 분자의 농도와 형광 미세 입자가 끌려오는 속도의 관계를 바탕으로 미지의 농도를 가진 생체 분자를 분석, 검출할 수 있다.
본 실험에서는 두 가지 실험이 수행되었는데 하나는 진드기 알레르겐 특이 항체 검출 시스템에 도입하기 위한 모델 실험으로써 토끼 IgG 검출 실험이 수행되었고, 다른 하나는 진드기 알레르겐 특이 항체 검출 실험이다. 첫 번째 실험에서는 polyclonal anti-rabbit IgG가 붙어 있는 50 nm 크기의 상자성 미세 입자, 1 μm의 적색 형광 미세 입자, 그리고 monoclonal rabbit IgG가 사용되었다. 두 번째 실험에서는 5.6 μm의 형광 미세 입자, 9 nm의 상자성 미세 입자, 그리고 사람 혈청에 있는 진드기 알레르겐 특이 항체가 사용되었다. 실험 전에 준비 사항으로 5.6 μm의 형광 미세 입자에는 D.farinae와 D.pteronyssinus 두 종류의 진드기 알레르겐을 결합시켰고, 9 nm의 상자성 미세 입자에는 진드기 알레르겐 특이 항체를 인식할 수 있는 anti-human IgE를 결합시켜 놓았다. 소자의 구조 면에서는 강자성체인 니켈 미세 구조를 도입하여 영구 자석에서 나오는 자기력선을 집속시킴으로써 자기장 구배를 강화하였다. 니켈 미세 구조는 유리 기판위에 도금으로 만들어졌고 미세 유체 채널을 가진 소자는 PDMS를 주형으로 하는 공정방법에 의해 제작되었다. 만들어진 두 소자는 플라즈마 처리를 통해 정렬되고 접합되었다. 이렇게 제작되어진 소자에서의 자기장 구배는 영구 자석의 것보다 훨씬 높은 약 $10^4$ T / m 까지 얻을 수 있었다. 이로 인해 이전 연구에서 얻은 검출 가능 최저 농도보다 약 250배 가량 낮출 수 있었다. 검출 범위는 토끼 IgG의 경우는 약 200 pg / mL에서 1 pg / mL까지 측정이 가능하였고 진드기 알레르겐인 D.farinae와 D.pteronyssinus에 특이 항체인 인간의 IgE는 각각 19.47 ng / mL에서 104 pg / mL, 10.68 ng / mL에서 151 pg / mL까지 가능하였다.
본 연구에서 사용한 5.6 μm 형광 미세 입자는 내부의 염료 비율을 달리함으로써 여러 가지의 형광을 얻을 수 있는 인코딩이 가능한 입자이다. 이 입자만 여러 가지로 바꿔주고 각각에 원하는 생체 분자를 결합하게 되면 이 시스템으로 다중 면역 검출이 가능하게 된다. 또한, 영구 자석보다 크기는 훨씬 작으면서 니켈 미세 구조를 도입한 경우만큼의 높은 자기장 구배를 실현할 수 있는 미세 전자석을 미세 소자에 통합한다면 본 연구과 같은 고감도이고 측정 한계가 낮은 분석 시스템이 구현될 수 있을 뿐만 아니라 집적화와 자동화가 가능해져 보다 효율적인 측정 센서 시스템을 구현할 수 있을 것으로 기대된다.
