Trehalase inhibitors due to their anti-fungal and insecticidal activities are considered to be valuable compounds in the plant protection industry. The major objectives of this study were to isolate a trehalase inhibitor from the broth of Streptomyces albus culture, and to identify its molecular structure. A combined separation process composed of solvent extraction, ion exchange chromatography, ultrafiltration and high performance liquid chromatography (HPLC) has been developed. An improved protocol has been also proposed for trehalase inhibitor assay. Lipids and proteins in micro-filtered broth sample were removed by extraction using butanol and methanol, respectively. The pretreated broth sample was treated by cation exchange chromatography with Dowex 50WX2 resin to recover the inhibitor that was in a protonated form under the given condition, and then by anion exchange chromatography with Amberlite IRA-67 resin to remove impurities. The ion-exchanged sample was filtered with an ultrafiltration membrane (MWCO 500) to remove large molecule impurities. The filtrate was fractionized by HPLC with $NH_2$ Luna column. The fraction with a retention time range of 11.33 - 11.89 min was picked and further analyzed for the identification of the inhibitor. Its molecular weight was found to be 318 - 330, which is different from that of salbostatin that was generally known to be produced by Streptomyces albus. It was observed by NMR and IR analysis to have amino- and sugar-alcohol structure like salbostatin.
이 실험의 주된 목적은 trehalase에 대한 저해제를 Streptomyces albus의 배양액으로부터 분리하고 이를 분석하는 방법을 확립하데 있다. 이 실험을 위해 효소반응을 통한 저해제의 활성을 시험하는 방법을 개발하였고 이 방법은 배양액과 각각의 분리 단계로부터 만들어진 샘플에 trehalase에 대한 저해제가 존재하는지의 여부를 판단하고 제안한 식을 통해 그 양을 비교하는데 적합하였다.
다량의 trehalase inhibitor을 얻기 위해서 Streptomyces albus가 저해제를 가장 많이 생산할 수 있는 배지조건과 기본 발효 조건을 선정하고 기본 발효 조건을 도출하였다. 배양액은 액-액 축출과 단백질 침전 등의 단계를 거쳐 전처리 하였으며 양이온과 음이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 사용하여 분리하였다. 저해제가 pH 4의 조건에서 양이온 교환 수지에 가장 많이 붙는다는 것을 알 수 있었으며, 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 저해제를 회수하였고 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 불순물을 제거하였다. 이온 교환 단계에서 분리된 분액 중 가장 높은 enzyme inhibition activity를 갖는 부분을 농축하였고 한외여과 법을 이용하여 분자량을 500 수준으로 분리하였다. 또한 동결건조를 통해 농축한 결과 trehalase 저해활성이 96 % 이상으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 농축된 샘플을 분취용 크로마토그래피를 이용하여 16 개의 구간으로 재 분리하였고 이를 효소반응을 통해 저해활성이 있는 구간을 3개의 구간으로 좁힐 수 있었다. 이 자료를 바탕으로 분석용 칼럼을 이용하여 재 분리하여 머무름 시간을 확정할 수 있었는데 저해제는 분석용 아민 컬럼을 이용하여 11.330 분에서 11.888 분 사이에 있는 peak에서 분리되는 것을 알 수 있었다.
분리된 샘플을 농축하여 NMR과 IR, MS를 이용하여 구조분석을 한 결과 저해활성을 갖는 물질은 318 또는 330의 분자량을 갖고 있으며 당-알코올, 아민-알코올의 구조를 갖는 것으로 나타났다. 그러나 $^1H$ NMR에서 valienamine 부분에 해당하는 endo double bond의 proton을 찾을 수 없었고 MS에서 321에 뚜렷한 peak이 없었기 때문에 분리된 물질은 Streptomyces albus로부터 생산되는 것으로 알려진 salbostatin (MW: 321)은 아닌 것으로 보인다. 따라서 이 연구를 통해 얻어진 trehalase inhibitor는 salbostatin과 다른 구조로서 높은 효소 저해 활성을 가지며, 아민기를 포함하는 당-알코올 구조의 새로운 저해제로 판단할 수 있었다. 그러나 앞으로 더 많은 양의 배양액을 이용한 분리와 이를 바탕으로 한 구조분석이 더 진행되어야 하며 그 후에야 비로서 분리한 저해제가 어떤 구조의 물질인지 확실하게 밝힐 수 있을 것으로 생각한다.
