In human cells, DNA damage induces two important cellular responses: removal of DNA damage as well as activation of a DNA damage checkpoint. In particular, nucleotide excision repair (NER) is the major pathway for repairing a wide rage of DNA lesions. DNA repair proteins XPA and ERCC1 are well-known to be the absolutely required for DNA-binding and incision steps of NER, respectively. ATR, ATRIP and hRad9 proteins are involved in the DNA damage checkpoints as representative damage sensors.
In order to elucidate XPA's specific role in regulating XPF-ERCC1 5' endonuclease complex in NER pathway, the specific association between XPA-ERCC 1 interaction should be investigated. Here, the interaction between XPA and ERCC1 has been examined using XPA (58-104) and ERCC1 (1-121) fragments. In vitro binding assays indicate that there is no particular domain-domain interaction between XPA (58-104) and ERCC1 (1-121). In addition, the biophysical characterization data in this study show that the interaction between the identified binding domains of XPA and ERCC1 is too weak to be recognized by NMR technique, possibly due to the extremely fast exchange. Otherwise, the determined binding domains of XPA and ERCC1 are insufficient for the protein-protein interaction. Likewise, XPA (72-84) and ERCC1 (93-120) fragments might not be the minimal binding domains for the mutual interaction as previously reported. Furthermore, this study provides some evidence that both XPA (58-104) and ERCCI (1-121) might be intrinsically unstructured, based on the primary sequence analysis, SDS-PAGE analyses of the purified proteins and thrombin cleavage reactions, and gel filtration chromatography data.
Two groups of proteins, ATR-ATRIP complex and hRad9-hHus 1-hRad 1 heterotrimer, have been identified as checkpoint-specific damage sensors to delay cell-cycle progression. To understand the mechanisms of DNA damage sensing, various plasmids harboring individual domains of ATR, ATRIP, and Rad9 were constructed. When the expressions, solubilities, and purifications of the recombinant proteins were characterized, most of the proteins were either unexpressed or insoluble. The partially soluble ones were not suitable for further functional studies due to the limited amount of the protein and the obstacles of purification. Additionally, the data presented here imply that the C-terminal domain of hRad9 might be intrinsically disordered. More advanced genetic strategies for recombinant protein expression in E. coil can be explored to finally obtain the satisfactory target for structural studies.
인간의 손상된 DNA를 회복하는 중요한 방법 중 하나인 NER (nucleotide expression repair)은 다양한 DNA 손상 종류를 인식하여 회복시킨다. 이 과정에서 XPA와 ERCC1은 서로 상호 작용 하여 핵심적인 역할을 담당하는 단백질로 알려져 있다. 본 연구에서는 XPA와 ERCC1의 어느 부분이 서로 결합하고 있고, 이 결합을 안정화 시키는 결합의 특징이 무엇인지 알아보기 위해 NMR을 이용하여 XPA-ERCC1 복합체의 생물리적 특성을 관찰하기로 하였다. 우선, XPA와 ERCC1의 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질들로부터 XPA (58-104)와 ERCC1 (1-121)을 선별하여 정제하였다. 그 후, 두 단백질 상호 간의 결합을 확인하게 위해, 어느 한 쪽의 단백질에 GST를 붙여서 in vitro pull-down assay를 수행하였고, 추가적으로 gel filtration chromatography와 NMR 실험을 통해 결합을 규명하고자 하였다. 그러나, 다양한 실험을 통해서도 이 두 XPA (58-104)와 ERCC1 (1-121) 단백질 간의 결합을 확인할 수 없었다. 이러한 관찰을 통해, 두 XPA (58-104)와 ERCC1 (1-121) 단백질 사이의 결합력이 너무 약해서 in vitro에서의 확인이 불가능 하거나, XPA-ERCC1 복합체는 도메인끼리의 결합만으로는 형성될 수 없으며 완전한 결합 구조를 형성하기 위해서는 XPA와 ERCC1의 다른 부분, 혹은 전체 단백질이 필요할 것이라는 가설을 제시하였다. 이와 동시에, XPA (58-104)와 ERCC1 (1-121)는 구조가 갖추어지지 않은 단백질이거나, 구조가 없는 도메인을 포함하는 단백질일 것이라는 가능성을 실험적으로 보여주었다.
또한 DNA의 손상을 회복하는 단계 이전에 세포 내에서 일어나는 가장 중요한 과정은 세포 주기의 진행 중단이다. 손상된 DNA의 복제를 일시적으로 정지시킴으로써 돌연변이의 복제를 막고, NER과 같은 DNA 회복 과정의 시간을 제공하는 단계이다. 본 연구에서는 이 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 ATR-ATIRP, hRad9의 단백질 구조 연구를 통해 이들의 정확한 기능을 알아보고자 했다. 그러나, 이러한 인간 종 단백질들을 박테리아에서 대량으로 발현시키는 데에 많은 어려움이 있었고, 구조 연구에 필요한 충분한 양의 단백질을 정제하는 과정에서 많은 장애가 발생되었다. 그러나, hRad9의 가장 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려진 C-terminal 도메인이 세포 내에서 구조적으로 완전하지 않은 상태로 존재할 것이라는 가능성을 제시하였다.
