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Expression and purification of recombinant human angiopoietin-4 produced in Chinese hamster ovary cells = CHO 세포를 이용한 고농도의 재조합 Human angiopoietin-4를 안정적으로 발현하는 세포주 제조와 발현 단백질의 정제
서명 / 저자 Expression and purification of recombinant human angiopoietin-4 produced in Chinese hamster ovary cells = CHO 세포를 이용한 고농도의 재조합 Human angiopoietin-4를 안정적으로 발현하는 세포주 제조와 발현 단백질의 정제 / So-Ra An.
저자명 An, So-Ra ; 안소라
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2006].
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초록정보

The angiopoietin (Ang) family of growth factors plays a role in both blood vessel sprouting and blood vessel regression. And it includes Angl, Ang2, Ang3, and Ang4, all of which bind to the endothelial receptor tyrosine kinase Tie2. Ang4 (human) is interspecies ortholog and an agonist of Tie2. Recombinant Chinese hamster ovary (rCHO) cell lines expressing a high level (7 ㎍/mL) of recombinant human Ang4 protein (rhAng4) with an amino-terminal FLAG-tag was constructed by transfecting the expression vectors into dihydrofolate reductase (dhfr)-deficient CHO cells and the subsequent gene amplification in medium containing stepwise increments in methotrexate level such as 0.02, 0.08, and 0.32 μM. The rhAng4 secreted from rCHO cells was purified at a purification yield of 53.3% from the cultured medium using an anti-FLAG M2 agarose affinity gel. SDS-PAGE and Western blot analyses showed that rCHO cells secret rhAng4 as a dominantly homodimeric glycoprotein form. Furthermore, rhAng4 binds to the Tie2 receptor and phosphortlates Tie2 in a concentration-dependent manner. Therefore, our rhAng4 could be useful for clarifying biological effect of exogenous Ang4 in future.

Angiopoietin (Ang)는 혈관의 생성과 퇴화에 관여하는 성장인자이다. 이러한 angiopoietin은 Ang1, Ang2, Ang3 와 Ang4의 4 종류로 이루어져 있으며, 모두 endothelial 세포 표면의 receptor인 tyrosine kinase Tie2와의 결합을 통해 작용한다. 이들 중 Ang4는 인간에게 존재하는 angiopoietin으로 Ang1과 비슷한 역할을 한다고 알려져 있지만, multimer 패턴 등을 고려했을 때 Ang4가 Ang1보다 더 유용한 치료용 단백질로써 사용될 수 있음을 고려해, 앞으로의 연구가 활발히 진행되기 위해서는 안정적으로 고농도의 Ang4를 발현하는 동물세포주가 필수적이라는 생각으로 실험을 진행하였다. Amino기의 말단에 FLAG를 추가한 재조합 인간 Ang4 유전자를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 도입하여 유전자를 증폭시킨 결과 배양 4일 째, 약 7 ㎍/mL 의 Ang4를 발현하는 세포주를 확립할 수 있었다. 발현된 Ang4의 FLAG 부분을 사용해 정제하여 53.3 %의 효율로 순수한 Ang4얻었고, 이 단백질은 SDS-PAGE와 western blot을 통해 분석되었다. 발현된 Ang4는 대부분 homodimeric glycoprotein 형태였으며, glycosylation 정도는 deglycosylation 실험을 통해 확인되었다. 마지막으로, 발현된 Ang4가 Tie2 phosphorylation에 성공적으로 관여하는 것을 확인함으로써 앞으로 Ang4를 연구하는데 유용하게 사용될 수 있음을 증명하였다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MBS 06005
형태사항 v, 44 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 안소라
지도교수의 영문표기 : Gyun-Min Lee
지도교수의 한글표기 : 이균민
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 Reference : p. 34-41
주제 Angiopoietin-4
CHO cell
Tie2 receptor
Chinese hamster ovary cell
Angiogenesis
CHO 세포
혈관생성인자
세포주 제작
단백질 발현
단백질 정제
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