Many physiological and behavioral activities exhibit 24-hour periodic rhythms. These rhythms exist in many organisms, prokaryote to human, and affect on many functions, basic cellular functions to higher neural activities. Organism exhibits the circadian rhythm with intrinsic cell-autonomous clock which is entrained by day and night cycle. The cell-autonomous clock consists with genetically based autoregulatory feed-back loop mechanisms. mPerl and mPer2 are major player of the feed-back loop. They contain PAS domains for dimerization and their mRNA and protein are rhythmically expressed. To understand the oscillation of the circadian clock in vivo, real-time reporting system for mPerl and mPer2 were developed in this study. By using the gene targeting method, mPerl:Luc knock-in ES cells were generated. For the dual monitoring purpose two different types of luciferase which are fire fly luciferase and rail road warm luciferase were fused at the end of exon 23. Various length of mPer2:: Luc:Neo constructs were stably transfected fibroblasts as a transcriptional model of mPer2. By means of real-time recording of bioluminescence, inducible expression of mPER1 in mPerl::Luc knock-in ES cell and oscillation of luciferase in various truncated mPerl::Luc reporter construsts were assayed. From the mPer2:: Luc transcriptional model, presence of multiple cis-acting elements which regulate phase, and robustness of oscillation of mPer2 was suggested.
다양한 생리학적, 행동학적 현상들이 24시간을 주기로 하는 리듬을 나타내고 있다. 이러한 리듬은 원핵 생물부터 인간에 이르기까지 다양한 생명체에서 나타나고 있고, 세포단위의 기본적인 생명 현상뿐만 아니라 고등한 신경계의 기능에 까지 영향을 미치고 있다. 이러한 생명체의 일 주기성 리듬은 세포단위의 내재적인 시계에 의해 생성되는데, 이 시계는 낮과 밤의 변화에 의해서 맞춰진다. 이러한 생체 리듬은 세포단위에서 유전자의 발현이 feed-back loop에 의해 조절에 의해 생기는 것으로 알려져 있다. mPer1과 mPer2는 이 feed-back loop에 관여하는 주요한 생체 시계 유전자로서, 이합체 형성을 위한 PAS domain을 가지고 있고, 이들의 mRNA와 단백질 양은 하루를 주기로 변화한다. 이러한 생체 시계의 주기적인 진동을 이해하기 위하여, mPer1와 mPer2의 변화를 실시간으로 관찰 할 수 있는 모델을 만들었다. 이 과정에서 mPer1::Luc knock-in ES cell과, 다앙한 길이의 mPer2 프로모터 부분의 construct를 가지고 있는 Rat1 fibroblast가 만들어졌다. 이 두가지 모델로부터 나오는 luminescence를 실시간으로 측정 함으로서, ES cell에서 mPER1 단백질의 발현과 fibroblast 모델에서 mPer2::luc reporter construct의 진동을 분석하였고, 후자의 모델로부터는 mPer2의 위상과 안정성을 조절하는 요소가 프로모터 영역에 다수 존재함이 제시되었다.
