More and more, aldolases are increasingly recognized as useful catalysts that carry out the reversible addition of a ketone donor to an aldehyde acceptor in achieving high stereoselectivity. Especially, threonine aldolase (TA) and 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase (HOA) were considered as potentially valuable biocatalysts in that both of them accept non-phosphorylated substrates unlike most of other aldolases that need phosphorylated substrates of which preparation is not trivial in organic synthesis. In spite of this advantage as biocatalysts, however, both of them have not been widely used in organic synthesis due to their low catalytic activity or low solubility. In this study, directed evolution and translational coupling have been employed to improve the catalytic activity of TA and HOA.
The novel LTA gene was cloned from Pseudomonas aeruginosa and overexpressed in a soluble form in E. coli. 50-60 mg of recombinant aldolase was purified to homogeneity from 1 L culture by one-step affinity column chromatography. The recombinant aldolase was characterized as a low-specificity LTA and showed the best catalytic activity at 30℃ in phosphate buffer of pH 7.0. To improve its catalytic activity, the directed evolution approach was applied to the recombinant LTA. On the basis of the toxicity of acetaldehyde, which is a substrate of LTA, two high-throughput screening systems were proposed. According to the positive selection scheme, the 2.1-fold enhanced catalytic activity was obtained.
MhpE aldolase (E. coli HOA) has been known as a member of 3-HPP catabolic pathway enzymes. When MhpE was overexpressed in E. coli, its solubility was largely dependent on the expression of MhpF. In vivo binding assay showed that MhpE was directly associated with MhpF. In addition, the translations of mhpF and mhpE genes were fully coupled by reinitiation mechanism although the mhpE gene has a Shine-Dalgarno sequence, which appears to be very efficient. When the mhpF and mhpE genes were expressed in two separate plasmid DNAs, the interaction between MhpF and MhpE decreased by 10-fold compared to that in translational coupling construct. This decrease in protein-protein interaction was recovered by coexpression of two genes in a polycistronic mRNA. This result indicates that translational coupling enhances the interaction between MhpF and MhpE and that the distance between translational sites of two genes can be an important factor for the protein-protein interaction. When the mouse endostatin was coexpressed with trigger factor, the solubility of mouse endostatin also increased as two genes were closely positioned, which supports that the closeness of two genes affects the efficiency of protein-protein interaction. Taken together, coexpression of two genes in close proximity ensures the efficient protein-protein interaction and the translational coupling is considered as a mechanism for optimizing the interaction of cotranslated proteins as well as for maintaining constant molar ratios among genes in a polycistronic mRNA.
알돌라아제는 탄소와 탄소를 결합시켜주는 반응을 촉매화하는 효소로 유기합성 반응에 유용한 것으로 주목 받아 왔으나 당 합성 과정을 제외한 다른 반응에서는 크게 이용되지 않고 있다. 특히 트레오닌 알돌라아제와 4-히드록시-2-케토발레릭산 알돌라아제는 인산기를 포함하지 않는 화합물들을 기질로 삼고 있어 응용 가능성이 클 것으로 생각되나 아직까지 연구된 예가 많지 않아 실제 유기합성 반응에의 이용은 거의 이루어지지 않는 상황이다. 본 연구에서는 이 두 알돌라아제를 대장균 내에서 과발현 시킬 수 있는 시스템을 구축하고 나아가 방향적 진화와 의존적 번역을 통한 활성 증가를 시도하였다.
먼저 현재까지 보고된 예가 없는 Pseudomonas aeruginosa 종으로부터의 트레오닌 알돌라아제 유전자를 클로닝 하였다. 이를 이용하여 대장균 내에서 과발현 시킨 뒤 정제하여 60 mg의 재조합 알돌라아제를 높은 순도 (>95%)로 얻어낼 수 있었다. 재조합 알돌라아제의 최적 조건은 pH 7.0, 30도로 결정되었고 이를 바탕으로 방향적 진화 과정을 통한 재조합 트레오닌 알돌라아제의 활성 증가를 시도하였다. 트레오닌 알돌라아제의 기질인 아세트알데히드가 대장균에 독성을 나타낸다는 실험 결과에 근거하여 고속 스크리닝 방법을 새로이 고안하였으며 이를 통해 활성이 2배 증가한 돌연변이 트레오닌 알돌라아제를 얻어낼 수 있었다.
4-히드록시-2-케토발레릭산 알돌라아제의 경우 대장균 내에서 과발현 시키면 침전이 생겨 정제가 어려웠으나 아세트알데히드 탈수소효소를 같이 발현시키면 침전이 생기지 않음을 관찰하였다. 두 단백질을 같이 발현시킨 뒤 정제하여 본 결과 두 단백질은 서로 직접 결합하고 있음을 알게 되었다. 또한 여러 돌연변이 유전자를 통한 실험 결과, 두 단백질의 유전자는 번역 과정이 서로 연관되어 있음을 새로이 밝혀낼 수 있었다. 이러한 두 유전자의 의존적 번역이 두 단백질 간의 결합에 미치는 영향을 알기 위하여 두 유전자의 번역 과정을 서로 다른 플라스미드 상에서 일어나도록 하였을 때, 두 단백질의 결합이 10배 정도 감소함을 관찰할 수 있었다. 그러나 이렇게 감소된 결합은 두 유전자 사이의 거리를 가깝게 가져감에 따라 다시 증가함을 알게 되었다. 이러한 현상은 mouse endostatin과 trigger factor의 예에서도 다시 확인할 수 있었다. 이를 통해 어느 한 단백질의 구조 형성 과정이 다른 단백질에 의해 크게 영향을 받는 경우 두 유전자의 번역 과정이 가까이서 일어나야만 두 단백질의 결합이 효과적으로 이루어질 수 있음을 알게 되었다. 이러한 관점에서 볼 때, 의존적 번역 과정은 단순히 두 유전자의 발현비를 조절하는 시스템일 뿐만 아니라 두 단백질간의 상호 결합을 최적화하기 위한 시스템임을 알 수 있었다.
