Numerous genome information was obtained using the result of genome sequences of many microorganisms, functional analyses of the genomes, comparative genomics, and bioinformatics. This information allows us to construct custom-designed microbes useful for human beings.
We have selected the transposable elements including IS element, prophage and phage remnant, virulence factors, biofilm, flagella, anaerobic respiration, nonessential protease, K-islands, and horizontally transferred genes as deletion target functions to construct artificial microorganism (custom-designed microbe) with a minimized genome.
To delete the selected target regions (genes), we developed efficient genome engineering techniques such as a Tn5-coupled Cre/loxP recombination system, a rapid markerless deletion system, and a bidirectional deletion system. In the Tn5-coupled Cre/loxP recombination system, we quickly and easily deleted many genomic regions without either creation of targeting vectors or complex PCR experiments, using two large loxP-inserted Escherichia coli genome libraries. We also deleted the genomic target regions without remaining of scar using the rapid markerless deletion system, in which the modified linear DNA recombination system, DNA repair mediated by double-strand breakage, and conditional expression of recombination proteins, Red and I-SceI, were combined. In addition, we used the bidirectional deletion system which is a transposon-based deletion technique allows bidirectional random deletion of genomic segments without prior knowledge of which genes are dispensable or prior sequence information.
Using these systems, we have individually deleted a total of 1.97 megabase pairs (about 42.5% of the E. coli genome) that does not seem to be essential for cell survival. And we have constructed E. coli with a minimized genome, ME54, in which 54 genomic regions were deleted by cumulative deletions. These deleted regions include large K-specific islands, prophage, phage remnants, restriction modification genes, flagella and chemotaxis related genes and all transposable elements including IS and Rhs (recombination hot spot) elements. The ME54 has the 25% (1.14Mb) reduced genome.
We characterized ME54 and found that eliminating nonessential genomic elements dramatically improves the utility of E. coli for cloning and expression. ME54 has no hopping of IS elements and became more sensitive to antibiotics than wild-type E. coli MG1655. In addition, the transformation efficiency of ME54 was about 20 times higher than that of MG1655 and the expression of recombinant proteins and secretion of the protein expressed was about 16% and 25% greater in ME54, respectively.
The results indicate that genome-minimized E. coli ME54 can be core genome of the custom-designed microbes because of its several advantages as a host in biotechnology, especially increased genome stability, increased susceptibility to antibiotics, higher transformation efficiency, and better production and secretion of recombinant foreign proteins.
본 연구에서는 유전체 염기서열이 완전히 밝혀졌고 그 기능도 대부분 알려진 대장균 유전체에서 주어진 대사여건에 불필요하거나 관여하지 않는 유전자들을 제거하여, 유용물질 생산에 적합한 유전자들로만 구성된 최소유전체의 인공균주(맞춤균주)를 개발하여 생명공학 산업에 필요한 기반을 제공하였다.
대장균의 생장에 불필요한 유전자로, 전위요소, prophage, phage잔존물, 독성인자, 생물막, flagella, 혐기성 호흡, 단백질 분해효소, K-islands, 외부도입에 관련한 기능의 유전자들을 선별하였다.
이렇게 선별된 불필요한 유전자 (유전체 부분)를 효과적으로 제거하기 위해서 Tn5-coupled Cre/loxP recombination system, rapid markerless deletion system, bidirectional deletion system과 같은 효율적인 유전체 공학 기법을 개발하였다. Tn5-coupled Cre/loxP recombination system에서는 유전체에 loxP가 고르게 삽입된 library를 구축해, 보다 쉽고 빠르게 다양한 유전체 부분을 제거할 수 있었다. Rapid markerless deletion system에서는 선형 DNA 재조합과 이중쇄 절단(double strand break)에 따른 DNA 복구, 단일 유전인자에서 재조합 관련 단백질의 조건적 발현 기법을 조합하여 아무런 외부 DNA의 흔적을 남기지 않고 불필요한 유전체 부분을 제거할 수 있었다. Bidirectional deletion system에서는 transposon GammaDelta의 intramolecular transposition을 이용하여 유전자의 염기서열이나 기능에 관한 정보 없이 한번의 실험으로 다양한 deletion mutant를 얻을 수 있었다.
이러한 유전체 조작 기법으로 대장균 유전체의 불필요한 부분을 각각 제거하여, 전체적으로 대장균 유전체의 42.5%에 해당하는 1.97Mb를 제거하였다. 그 뒤, 개별적으로 제거된 유전체 부분을 cumulative deletion을 통하여 하나의 유전체로 옮겨, 54 유전체 부분, 전체 유전체의 25%에 해당하는 1.14Mb가 제거된 대장균 ME54를 구축하였다.
최소유전체의 대장균 ME54는 야생형 대장균 MG1655에 비해, 재조합 단백질 생산이 20%, 형질전환 효율이 20배, 항생제 민감성이 4배 증가하였다. 또한 IS hopping이 일어나지 않아 돌연변이 발생확률이 현저히 낮았다.
결론적으로, 대장균 유전체를 최소화 함으로써, 유전체 안정성, 항생제 민감성, 형질전환 효율, 재조합 단백질의 생산과 같은 생명공학 분야의 발전에 핵심적인 특징을 지닌 인공균주 (맞춤균주)를 구축하였다.
