For the production of transgenic plants with commercial and environmental applications, both development of transgenic methods and exploration of genes with utilizable traits should be performed in parallel. In my research, I aimed at, first, the development of revised co-transformation method using negative selectable marker gene to segregate out the progenies with selectable marker genes easily and, next, exploration of genes involved in stress response in Arabidopsis.
A negative selectable marker gene, codA, was successfully co-transformed with GUS reporter gene to develop selectable marker gene-free transgenic plants. The pNC binary vector contained a T-DNA harboring the codA gene next to the nptii gene, while a second binary vector, pHG, contained a GUS reporter gene. Tobacco plants (Nicotiana tabacum Samsun NN) were co-transformed via the mixture method with Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strains harboring pNC and pHG, respectively. Seeds harvested from the co-transformants were sown on germination media containing 5-fluorocytosine (5-FC). Analysis of the progeny by GUS staining and PCR amplification revealed that all of the 5-FC-resistant R1 plants were codA-free, and that the codA gene segregated independently of the GUS gene. Because codA-free seedlings developed normally on 5-FC-containing medium, co-transformation with negatively selectable markers is a viable method for the production of easily distinguished selectable marker gene-free transgenic plants.
While searching for the genes applicable for the production of plants with new traits such as stress-tolerance, I identified and characterized the Arabidopsis VEC1 (Vesicular trafficking-associated C2 domain protein), a novel plant-specific protein that is unusually small in size and has a unique primary structure. VEC1 is highly abundant in glycine, tyrosine, and proline. Their compositions correspond to about 50% of total amino acids composition and also almost all of them are positioned in GYP-rich region. Gene expression analysis revealed that transcription of VEC1 in leaves was induced by aging and wounding. Biochemical analyses using phospholipid overlay assay revealed that VEC1 binds with phosphatidyl inositol-monophosphate and other interacting proteins in a $Ca^{2+}$ -dependent manner. Membrane fractionation experiment showed that VEC1 is localized at the membrane as predicted in Hydropathy plot. Transient expression of C2 domain deletion mutants in Arabidopsis protoplast revealed that movement between plasma membrane membrane and small motile vesicles requires the C2 domain. Collectively, these findings indicate that VEC1 is a C2 domain protein involved in vesicular trafficking. VBP1(VEC1 binding protein) was shown to be a VEC1 binding protein by interaction assay in yeast, in vitro, and in vivo. It has high contents of glycine, tyrosine, proline, alanine, histidine, and lysine. Among them glycine, alanine, and tyrosine are rather dispersed throughout the protein but proline, histidine, and lysine are concentrated at N-terminal half (VBP1-N), at C-terminal half (VBP1-C), and at C-terminal end (VBP1-K), respectively. Such a bipartite primary structure of VBP1 is also conserved in another two AtVBP homologues. Transient expression assay in Arabidopsis protoplast revealed that gfp protein fused with VBP1 was localizaed at small motile vesicles and nucleus and VBP1-K was sufficient to localize VBP1 to nucleus. To check the gene expression profile of VBP1 over-expressing Arabidopsis plant, GeneChip experiment was performed and the results were confirmed by RT-PCR analysis. Most genes down-regulated in VBP1 over-expressing plant are induced in salt-stressed Arabidopsis, which means the implication of VBP1 as a repressor of genes induced by salt-stress.
유용한 형질전환 식물체의 육성을 위해서는 형질전환 기술과 유용 유전자의 발굴이 병행되어야한다. 이를 위해 본 연구에서는 역선발표지유전자를 이용한 개선된 동시형질전환방법을 고안하고 검증할 뿐만 아니라, 애기장대에서 스트레스에 반응하는 유전자 중의 하나인 VEC1과 VBP1 단백질의 특성을 규명하고자 한다.
역선발표지유전자 codA 를 GUS reporter 유전자와 동시형질전환하여 선발표지유전자가 제거된 형질전환식물체를 육성하였다. 이를 위해 codA와 nptii유전자를 갖는 pNC binary vector와 GUS reporter 유전자를 갖는 pHG binary vecotr를 제작하였다. 이들을 형질전환한 Agrobacterium tumefaciens LBA4404를 이용하여 담배 (Nicotiana tabacum Samsun NN) 형질전환을 수행하였다. 동시형질전환식물체로부터 씨를 얻어 5-FC (5-fluorocytosine)을 함유한 배지에서 발아시켰다. 그 결과 모든 5-FC 저항성 식물체는 codA 유전자를 함유하지 않았으며, codA는 GUS 유전자와 독립분리됨을 확인하였다. codA가 없는 식물체가 정상적으로 5-FC 배지에서 성장하는 것으로 보아, 본 연구의 역선발표지유전자를 이용한 동시형질전환법은 선발표지유전자가 제거된 형질전환식물체를 제작하는데 적용될 수 있다.
각종 스트레스 저항성 유전자의 하나로 애기장대에서 식물특이적인 VEC1 (Vesicular trafficking-associated C2 domain protein)를 찾아냈다. VEC1은 크기가 작을 뿐만 아니라, 독특한 일차구조를 가진 단백질이다. 먼저 VEC1은 glycine, tyrosine, proline의 함량이 매우 높다. 이는 전체 아미노산의 약 50%에 해당하며, 이들 대부분은 GYP-rich region에 위치한다. VEC1은 상처와 노화에 의해 유도된다. 생화학적 실험을 통해 VEC1은 $Ca^{2+}$ 에 의존적으로 phosphatidyl inositol-monophosphate와 부착함을 확인하였다. VEC1이 hydropathy plot에서 예측한대로 막에 위치함을 막분리실험을 통해 확인하였다. 애기장대 원형질체에서 VEC1의 돌연변이 단백질을 발현시켜, VEC1이 C2 domain의 존재에 의존으로 세포막과 vesicle 간을 이동함을 확인하였다. 즉, 이러한 결과로부터 VEC1이 전달에 연관되어 있다는 추측을 할 수 있다. 여러 실험을 통하여 VBP1(VEC1 binding protein)이 VEC1과 부착함을 확인하였다. VBP1은 높은 함량의 glycine, tyrosine, proline, alanine, histidine, lysine을 함유하고 있으며, 이들 중 glycine, alanine, tyrosine은 고루 분포되어 있지만, proline은 N-말단의 반 (VBP1-N)에, histidine은 C-말단의 반 (VBP1-C)에, lysine은 C-말단부 (VBP1-K)에 편재되어 있다. 이러한 bipartite 구조는 애기장대의 VBP1 유사단백질에 잘 보존되어 있다. 애기장대 원형질체에서의 발현실험을 통하여, VBP1이 핵과 vesicles에 위치함을 확인하였고, 특히 핵 위치를 위해 VBP1-K 단편이 충분한 조건임을 확인하였다. VBP1의 유전자 발현양상을 보기위해 VBP1 과발현 형질전환 애기장대를 이용하여 GeneChip 실험을 수행하고, 결과를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 대부분의 salt-유도 유전자들이 VBP1 과발현 애기장대에서 발현량이 감소함을 확인하였다. 이는 VBP1이 salt-스트레스의 repressor로 작용함을 의미한다.
