To obtain antimicrobial peptide from a traditional fermented food, Lactococcus lactis subsp. lactis MY23 was isolated among hundreds of strains from Kimchi based on antimicrobial activity screening for Propionibacterium acnes. The culture broth of Lactococcus lactis subsp. lactis MY23 showed selective antimicrobial activity against a few pathogenic bacteria including Propionibacterium acnes, Listeria monocytogenes, and Rothia dentocariosa. The antimicrobial peptide, named lactococcin K, was purified to a 70.8 fold increase by Mono S column chromatography, Phenyl-Superose hydrophobic interaction chromatography, and NH2 normal-phase chromatography. The purified lactococcin K was inactivated by proteolytic enzymes such as trypsin and protease K, but not by lipase, lysozyme, or glucanase. The molecular size of the native lactococcin K was 5.5 kDa in tricine/SDS-PAGE active staining. The structural gene of lactococcin K, lcnK, was cloned from the whole genome of Lactococcus lactis subsp. lactis MY23 and was expressed in an Escherichia coli JM105. The recombinant bacteriocin produced by E. coli was more stable to heat and pH than that of the parent strain. The molecular mass calculated from the amino acid sequence of lcnK is a half of purified native lactococcin K and recombinant peptide from E.coli. The lcnK was amplified by PCR and was subcloned into pET-21c(+) expression vector (pTMY). The evaluation of antimicrobial activity of transformant containing the plasmid pTMY revealed that the recombinant peptide, lcnKⅡ, has a similar inhibitory activity against the indicator strain. These data suggest that the native form of lactococcin K is a homodimer. Because lcnKⅡ was easily digested with protease in E.coli host, we made a fusion protein containing lcnKⅡ and Maltose binding protein (MBP). The resulting plasmid, pBMBPB, containing MBP gene, lcnK and enterokinase cleavage-site was used to transform E. coli BL21(DE3). A fusion protein from E.coi BL21(DE3) containing the plasmid pEMBPB was produced in pH-stat fed-batch cultures. It was expressed as soluble form and not digested in host cell. The production of fusion protein during fed-batch cultures was not related with the effect of cell density at the time of induction.
박테리오신(Bacteriocin)은 유산균이 생산하는 항균성 단백질로서 식품의 방부제로 오랫동안 검토되어 왔다. 박테리오신의 또 다른 이용 분야로는 구강 제품이나 피부 제품, 화장품 등의 천연 항균 성분으로의 사용이다. 이러한 화장품 등에 의해 예방될 수 있는 피부 질환 중 여드름은 청소년기에 피하 지방 분비 과다 및 여드름 균이 염증을 일으켜 발생하는 것으로 이를 예방할 수 있는 천연 소재로서 박테리오신의응용 가능성은 매우 높다.
본 연구에서는 김치로부터 항균성 단백질을 생산하는 유산균인 Lactococcus lactis subsp. lactis MY23을 분리하고 박테리오신의 유전자 확인을 통해 이를 대장균(Escherichia coli)을 이용하여 대량 발현시켰다. 유산균에 의해 생산된 박테리오신은 여드름 균에 대해 매우 높은 항균 활성을 나타냈고, 다른 구강 질환균 등에도 항균 활성을 나타내었다. 정제 과정을 통해 순수 분리된 박테리오신은 분자량이 5.5KDa 수준으로 비교적 작은 크기의 ClassⅡ에 속하는 박테리오신 이었다.
이러한 박테리오신의 발현을 위해 Lactococcus lactis subsp. lactis MY23의 chromosomal DNA를 분리하여 pUC18 plasmid에 클로닝하여 Eschercia coli JM105에서 생산되도록 하였다. 이렇게 생산된 재조합 박테리오신은 열이나 pH에 대한 안정성이 유산균이 생산하는 박테리오신에 비해 크게 향상되었다. 보다 효과적인 생산을 위해 박테리오신의 유전자 분석을 실시한 결과 박테리오신 유전자로부터 22개의 아미노산으로 구성된 단백질이 생산되어 2개가 연결된 구조가 형성됨을 추정할 수 있었다.
이 유전자를 이용한 재조합 단백질의 대량 생산 과정에서 이 유전자에 의해 발현된 단백질이 배양 과정 중 단백질 분해 효소 등에 의해 분해 되는 것으로 확인되어 보다 안정적으로 생산 하고자 Maltose binding protein에 이 박테리오신을 연결하여 fusion 단백질의 형태로 생산하도록 하였다. 이 단백질은 발효 과정 중 균 농도가 $O.D_{600} =100$ 수준에 이를 때까지도 IPTG 투입 시간에 관계없이 균의 성장에 비례하여 생산됨이 확인되었고, 이를 통해 천연 원료로의 대량 생산이 가능하였다.
