Saccharomyces cerevisiae Dna2, which possesses endonuclease and helicase activities, plays a critical role in Okazaki fragment processing. To gain further insight into other genes acting in conjunction with Dna2 during Okazaki fragment processing, we performed systematic synthetically lethal (or sick) screening using mutant cells containing dna2Δ405N, a dna2 allele lacking the N-terminal 405 amino acids that displays a temperature-sensitive growth defect. This approach aims to define the pathways that are critical to repair DNA lesions caused by dysfunction of the dna2 mutation. Moreover, it could allow us to find a bypass pathway, in which cells do not require a functional Dna2 for processing of Okazaki fragments.
We found that dna2Δ405N exhibits synthetic growth defect with several gene involved in DNA repair such as srs2Δ and sgs1Δ, which plays a role in double-strand -break (DSB)-initiated homologous recombination repair. In support of this, rad51Δ, a yeast paralog of RecA, showed growth defect with dna2Δ405N when DNA damages were imposed. As expected, a mutation in TOP3 encoding topoisomerase III, is also synthetic lethal with dna2Δ405N, since TOP3 is required for a normal function of SGS1. In addition, we found that defects in POL32 and PIF1, the two genes implicated in displacement DNA synthesis that lead to flap formation, suppressed temperature-sensitive phenotype of dna2Δ405N. Moreover, pif1Δ suppressed the null mutation of dna2. These findings suggest either that the length of flap in the absence of pif1 or pol32 mutation is extremely short or that flaps do not form altogether, thus allowing the cells to bypass the requirement of a functional Dna2.
In summary, our results demonstrate that replication errors accumulated by dysfunction of Dna2 during Okazaki fragment processing are corrected largely by DSB-initiated homologous recombination and that the requirement of Dna2 can be bypassed by suppressing the displacement DNA synthesis, most likely at high risk of elevated mutation rate during DNA replication.
발아 효모인 Saccharomyces cerevisiae 의 단백질인 Dna2 는 헬리케이즈와 엔도뉴클리에이즈 효소작용을 지니어 Okazaki fragment 처리함에 있어 중요한 역할을 하고있다. Okazaki fragment 처리 과정 중 Dna2 와 합동하여 작용하는 유전자를 찾기 위해 Dna2의 아미노말단 405아미노산이 결여된 고온민감성 돌연변이체 (dna2Δ405N) 와 다른 DNA 복제/복구에 관련된 유전자의 유전적 상호관계를 알아보았다. 이러한 유전학적 실험으로서 Dna2 의 기능결함 시 발생하는 DNA 복제이상의 복구경로를 알아보고자 하였고 나아가서 Dna2부재시 Okazaki fragment 처리의 우회경로를 알아보았다.
dna2Δ405N 돌연변이체는 Double Strand Break(DSB)로 기인한 유전체 재조합 경로에 관여하는 srs2 와 sgs1에 결함이 생기면 생존에는 영향이 없었으나 생장속도가 매우 느렸다. 또한 dna2D405N 돌연변이체는 대장균 RecA 와 유사한 기능을 가진 rad51 돌연변이와도 DNA 손상조건 시 극명한 생장저하를 보여주었다. 유전체 재조합 과정 중 DNA 중간체의 정상적인 분해를 돕는 top3 가 dna2Δ405N 돌연변이체에 추가적으로 결손이 되었을때 발아효모는 살지 못하였다. 이에 더해서 DNA 헬리케이즈 역할을 지닌 pol32 와 pif1 돌연변이는 dna2 돌연변이체의 고온민감성 표현형을 억제하였고 나아가 pif1 돌연변이는 dna2 부재시에도 효모는 죽지 않고 살아남을 발견하였다. 이는 Pol32 와 Pif1 의 결함 시 생겨나는 짧은 길이의 Okazaki fragment 단일가닥 flap 부분이 Dna2의 역할을 완전히 필요로 하지 않기 때문이라고 짐작할 수 있다.
이러한 실험결과로 Dna2 의 결함으로 축적되는 DNA의 복제불량을 복구하기 위해서 발아효모가 이용하는 주요한 복구경로로는 DSB로 기인한 유전체 재조합 경로이고 나아가 Okazaki fragment 단일가닥 flap 생성이 억제될수록 세포는Dna2에 비의존적이 될 것이다.
