Mutations in BRCA 1 gene are associated with breast and/or ovarian cancer development and seem to be responsible for approximately 2-5% of all breast cancer cases in the general population. The BRCA I gene, which was isolated by positional cloning, is composed of 22 coding exons distributed over approximately 100 kb. Up to now, more than 1,500 distinct variations of BRCAI have been registered in the BIC database. Breast cancer is the most common cancer in Korean women, although the incidence is lower than in the Western population. Due to rapid westernization of life style, the incidence of this disease and its associated death rates have markedly increased in Korea and BRCAI mutations are considered to be involved in a large portion of all familial breast cancer. Therefore, the need for a reliable diagnosis of the mutations is becoming more important.
We investigated immobilization efficiency of several coupling strategies which could be used in a DNA microarray. The coupling strategy of aminated DNA to glass supports modified with aldehyde is best practical method to make DNA microarrays and it does not require any coupling agent which could be a source of variability during the spotting with an automatic devices.
We developed an efficient microarray-based multiplex assay to detect Korean-specific mutations in breast cancer susceptibility gene BRCAI using direct probe/target hybridization. Allele-specific oligonucleotides were covalently immobilized on aldehyde-activated glass slide to prepare an oligonucleotide chip. From a wild type sample, two-step method was used to generate labeled multiplex PCR amplification products of genomic regions containing the mutation sites. Hybridization of the labeled PCR products to the oligonucleotide chip successfully identified all of the genotypes for the selected mutation sites.
For more reliable diagnosis, we employed a multiplex assay strategy to detect Korean-specific mutations in breast cancer susceptibility gene BRCA1 using single base extension (SBE) reaction with zip-code microarray. Multiplex PCR amplification was performed to amplify the genomic regions containing the mutation sites. The PCR products were then employed as templates in subsequent four separate multiplex SBE reactions, one with each of four different biotin-labeled dideoxy NTPs (ddNTPs) and the other three unlabeled ddNTPs. Hybridization of the SBE products to zip-code microarray followed by staining with streptavidin-Cy3, leaded to successful genotyping of several BRCA1 mutation sites with a wild-type and several heterozygote mutant samples.
This work demonstrates that DNA microarray-based analysis is a good candidate for efficient clinical testing for BRCA1 mutations and represents one of the few successful verification of the DNA microarray-based reliable diagnosis of human genetic mutations.
BRCA는 유방암 및 난소암의 유전적 원인이 되는 genetic susceptibility gene이고, 대략 유방암의 7%, 난소암의 10%가 이 유전자들의 돌연변이와 관련이 있는 것으로 알려지고 있다. 서양 지역보다는 발병률이 낮지만, 유방암은 한국여성에 있어서 가장 많이 발생하는 암이다. 생활 패턴이 점점 서구화 되면서 이러한 질병들의 발병이나 이와 관련된 사망률이 점점 증가하는 추세이고, BRCA gene의 변이는 이러한 대부분의 유전적인 유방암을 가지고 있는 가계의 주요한 원인이 된다.
이러한 한국인 특이 BRCA gene의 변이를 빠르고 정확하게 진단할 수 있는 DNA microarray을 개발하였다. 먼저 DNA microarray을 만들기 위하여 capture probe를 chip에 고정화 하는 여러 가지 방법에 대해 고정화 효율을 비교하였다. 여러 가지 방법 중 amine modification된 DNA probe를 aldehyde modified glass 위에 고정화 하는 방법을 이용하여 만든 DNA microarray가 가장 효율성이 좋다는 결과를 얻었다. 또한, 이러한 방법은 DNA microarray 제작 과정 중 문제를 발생 시킬 수 있는 다른 coupling agent를 사용하지 않고 만들 수 있다.
이렇게 최적화한 조건들을 이용하여 direct probe/target hybridization 방법을 이용하여 한국인 특이 BRCA gene의 변이를 진단할 수 있는 DNA microarray를 개발하였다. Aldehyde activated glass 표면에 대립 형질에 특이적인 sequence를 갖는 oligonucleotide를 고정화 하여서 oligonucleotide chip을 제작하였다. BRCA gene의 mutation site를 진단하기 위하여 two-step method를 이용하여 형광이 labeled된 PCR product을 wild-type의 유전자를 가지고 있는 sample로부터 만들었다. 이렇게 만들어진 형광을 가지는 PCR product을 oligonucleotide chip에 hybridization 시키는 방법을 통하여 한국인 특이적인 11개의 mutation site를 성공적으로 진단하였다.
유전자 진단 방법 중 single base extension (SBE) 와 zip-code microarray를 한국인 특이 BRCA 유전자 변이 진단에 이용하였다. Multiplex PCR을 이용하여 mutation site를 포함하는 PCR amplification product를 만들었다. 이렇게 만들어진 PCR product을 template로 사용하여, 4개의 서로 다른 multiplex SBE 반응을 수행하였다. 이러한 SBE reaction product를 zip-code microarray에 hybridization 시킨 후, streptavidin-Cy3을 반응시켜 결과를 확인하였다. 한국인 특이적인 BRCA gene mutation을 갖는 sample과 mutation이 없는 sample을 SBE와 zip-code microarray를 이용하여 테스트 하여서 성공적으로 mutation의 여부를 진단할 수 있었다.
DNA microarray나 나노-바이오테크놀리지에 많은 응용이 가능한 biomolecule conjugated nano-particle 을 만드는 연구를 수행하였다. 먼저 gold 염에 환원제를 첨가하여 일정한 size 분포를 갖는 서로 다른 크기의 gold nano-particle을 만들고, 이렇게 만들어진 gold nano-particle에 thiol group을 가지고 있는 11-mercaptoundecanoic acid (MUA)나 mercaptosuccinic acid (MSA)등을 고정화 하였다. 고정화 된 alkanethiol self-assembled monolayer (SAM)의 한쪽 끝에 있는 carboxylic acid group 과 streptavidin의 amine group를 반응 시켜서 성공적으로 streptavidin을 gold nano-particle에 고정화 하였다. 이렇게 만들어진 streptavidin conjugated gold nano-particle은 biotin-streptavidin반응을 통하여 DNA microarray및 나노-바이오테크놀로지에 응용이 가능하다.
본 연구에서는 한국인 특이적인 BRCA mutation site를 진단할 수 있는 DNA microarray를 이용한 multiplex assay 기술을 개발하였다. 이러한 결과는 DNA microarray를 한국인 특이적인 BRCA 유전자 변이 진단에 실질적으로 사용 가능하다는 것을 확인 하였고, 여러 가지 다른 질병과 관련된 유전적 변이의 진단에도 응용 가능하다.
