Nanog, an embryonic stem cell-specific homeodomain transcription factor, has been shown recently to play a crucial role in maintaining pluripotency of embryonic stem (ES) cells. The molecular mechanism of how Nanog regulates stem cell pluripotency, however, remains unknown. Here, we demonstrated that Nanog recruits the CtBP1 corepressor and HIPK2 to downregulate target gene expression in ES cells. We showed that Nanog can act as either a transcriptional repressor or an activator, depending on functional domains. The activation domain mapped to the C-terminal half of the protein (aa 161-305) whereas the repression domain (a.a.82-250) mapped to the middle portion of the protein that overlaps with an activation domain through the tryptophan-repeat (WR) domain. As a transcriptional repressor, Nanog physically interacted with the CtBP1 corepressor. Furthermore, the Nanog-mediated transcriptional repression of target genes was augmented by CtBP1, indicating that CtBP1 acts as a corepressor of Nanog. In cultured cells, Nanog colocalized with the HIPK2 protein kinase, and imunoprecipitation and GST-pull down assays revealed its direct interaction with HIPK2. However, we found that coexpression of the wild type HIPK2, but not of the kinase-dead HIPK2(KR), relieved repressor activity of Nanog. Interestingly, both CtBP 1 and HIPK2 interacted with Nanog via the WR domain, and deletion of the WR domain abolished Nanog interactions with CtBP1 and HIPK2, concomitant with the loss of its repressor activity. Using chromatin immunoprecipitation (CHIP) assays, we demonstrated that in ES cells, Nanog bound to GATA6 promoter and recruited the CtBP1 corepressor to downregulate GATA6 gene transcription. Upon the treatment of ES cells with retinoic acid to induce differentiation, Nanog no longer bound to the GATA6 promoter, thereby relieving transcriptional repression mediated by CtBP1. Together, our results provide the first evidence that Nanog recruits CtBP 1 and HIPK2 for its transcriptional activity and imply novel regulatory roles of CtBP1 and HIPK2 in maintaining pluripotency of ES cells through modulation of the Nanog activity.
Nanog는 배아줄기세포에 특이적으로 존재하는 전사조절 인자로서, 최근에 발견되었다. 배아줄기세포의 다형성 능력을 유지하는데, 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌으나, 그 분자생물학적인 기전은 거의 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 Nanog 단백질이 목적 유전자의 발현을 억제함에 있어, CtBP1과 HIPK2라는 전사억제 보조인자와의 물리적, 기능적인 상호작용을 필요로 함을 면역침전법, 세포염색법, 전사활성분석법 등을 이용하여 증명하였다. Nanog는 전사를 억제할 뿐만 아니라 전사 활성화에도 작용하는 것을 확인하였는데, 161~305 아미노산 부위로 이루어진 카르복시 말단부위가 전사 활성화에 작용하는 것으로 나타났고, 트립토판 반복서열을 포함하는 82~250 아미노산 부위가 전사 억제 기능에 필수적임을 확인하였다. 전사 억제에 작용하는 Nanog와 전사 억제 보조인자인 CtBP1 간의 물리적인 상호작용을 확인하였다. 실제로, CtBP1에 의해 Nanog에 의한 목적 유전자의 전사 억제 활동이 강화되는 것을 확인하여, CtBP1이 Nanog의 전사 보조 인자로써 작용함을 증명하였다. CtBP1과 마찬가지로 전사 억제 보조인자로써 알려진, HIPK2라는 단백질 인산화 효소에 대해서도 여러 실험을 통하여 Nanog와의 물리적인 상호작용을 확인하였다. 하지만, HIPK2의 경우에서는 CtBP1과는 달리, Nanog의 전사 억제 활성을 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였고, 이러한 감소 효과는 인산화 능력을 없앤 HIPK2 돌연변이체에 의해서는 나타나지 않았다. 흥미롭게도, CtBP1과 HIPK2 모두 Nanog의 트립토판 반복서열 부위와 결합하는 것을 보였고, Nanog의 트립토판 반복서열 부위를 제거했을 경우에는 그들 간의 상호작용이 나타나지 않았고, Nanog의 전사 억제 효과도 소실되는 것을 확인하였다. Nanog와 CtBP1이 GATA6 promoter 부위에 복합체를 형성하는 것을 염색체 면역침전법을 통해 확인하였다. 이는 Nanog와 CtBP1이 GATA6 유전자의 발현을 억제하여 배아 줄기세포의 특징을 유지하도록 기여함을 증명한다. 배아 줄기세포에 retinoic acid를 처리하여 분화를 유도했을 경우에는 Nanog의 발현이 중단되었고, 전사 억제 효과도 소실되어 GATA6 유전자의 발현이 유도되고, 내배엽 형태를 띠는 세포로 분화되는 것을 확인하였다. 지금까지의 결과를 통해, Nanog의 전사 조절 활성을 나타내는데 있어, CtBP1과 HIPK2를 필요로 함을 최초로 증명하였고, CtBP1과 HIPK2가 Nanog의 활성을 조절 함으로써 배아 줄기세포에서의 다형성을 유지하는데 작용한다는 새로운 기능을 밝혀내었다.
