In mammalian cells, nucleotide excision repair (NER) is the major pathway for the removal of bulky DNA adducts. Many of the key NER proteins are members of the XP family (XPA, XPB, etc.), which was named on the basis of its association with the disorder xerodoma pigmentosum. Human replication protein A (RPA), the ubiquitous single stranded (ss) DNA binding protein, is another of the essential proteins for NER. RPA stimulates the interaction of XPA with damaged DNA by forming an RPA-XPA complex on damaged DNA sites. Binding of RPA to the undamaged DNA strand is most important during NER, because XPA, which directs the excision nucleases XPG and XPF, must bind to the damaged strand. In this study, NMR spectroscopy was used to assess the binding of the tandem high affinity DNA binding domains, RPA70AB, and of the isolated domain RPA70A, to normal DNA and damaged DNA containing the cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) lesion. Both RPA70A and RPA70AB were found to bind nonspecifically to both strands of normal and CPD-containing DNA duplexes. There were no differences observed when binding to normal DNA duplex was examined in the presence of the minimal DNA binding domain of XPA(XPA-MBD). However, there is a drastic difference for CPD-damaged DNA duplex as both RPA70A and RPA70AB bind specifically to the undamaged strand. The strand-specific binding of RPA and XPA to the damaged duplex DNA shows that RPA and XPA play crucial roles in damage verification and guiding cleavage of damaged DNA during NER.
Replication Protein A (RPA) is a three-subunit complex with multiple roles in DNA metabolism. DNA binding domain A in the large subunit of human RPA (hRPA70A) binds to single-stranded DNA (ssDNA) and is responsible for the species-specific RPA--T antigen (T-ag) interaction required for Simian Virus 40 replication. Although Saccharomyces cerevisiae RPA70A (scRPA70A) shares high sequence homology with hRPA70A, the two are not functionally equivalent. To elucidate the similarities and differences between these two homologous proteins, we determined the solution structure of scRPA70A, which closely resembled the structure of hRPA70A. The structure of ssDNA-bound scRPA70A, as simulated by Residual Dipolar Coupling-based homology modeling, suggested that the positioning of the ssDNA is the same for scRPA70A and hRPA70A, although the conformational changes that occur in the two proteins upon ssDNA binding are not identical. NMR titrations of hRPA70A with T-ag showed that the T-ag-binding surface is separate from the ssDNA binding region and is more neutral than the corresponding part of scRPA70A. These differences might account for the species-specific nature of the hRPA70A--T-ag interaction. Our results provide insight into how these two homologous RPA proteins can exhibit functional differences, but still both retain their ability to bind ssDNA.
RPA는 DNA의 복제, 조합, 수리 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질이다. 70 kDa, 32 kDa, 12 kDa 의 세 폴리 펩타이드로 이루어져 있으며 외가닥 DNA에 결합하는 여러 도메인들을 가지고 있다. 70 kDa의 가운데 부분에 위치하는 DNA 결합 도메인 A는 외가닥 DNA에 가장 잘 결합한다. UV에 의해 손상된 DNA를 수리할 때 사용되는 방법 중 하나인 Nucleotide Excision Repair에서 RPA는 외가닥 DNA, XPA와 상호작용하여 손상된 가닥이 잘려 다시 합성될 수 있도록 유도하는 역할을 할 것으로 여겨져 왔다. 우리는 RPA의 DNA 결합 도메인 A와 B의 어느 부위가 DNA와의 상호작용에 관여하는지 NMR 실험을 통해 밝혔다. 또, 정상 DNA 이중나선과 한 가닥이 UV 손상 DNA인 이중나선을 이 단백질들과 결합시켜 봄으로써 RPA가 이중 나선의 양 가닥에 자유롭게 결합하는 것을 알았다. 그러나 XPA-MBD가 존재하는 상황에서 RPA는 손상되지 않은 가닥에 주로 결합하였다. 이 결과는 RPA-XPA가 손상된 DNA를 가지고 있는 이중 나선에 가닥 특이적으로 결합함으로써 손상된 가닥이 잘릴 수 있도록 돕는다는 것을 보여준다. RPA는 DNA 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질인 만큼 모든 진핵 생물에 보존되어 있다. S. cerevisiae의 RPA는 유전학적으로 많이 연구되어 왔으며 인간 RPA와 유사성이 매우 높다. 그러나 이들은 SV40 복제 등에서 종별 특이성을 보여 이를 설명하기 위해 DNA 결합 도메인 A (scRPA70A) 의 구조를 NMR 실험에 기반하여 계산하였다. 이를 통해 scRPA70A의 구조와 외가닥 DNA와의 상호작용 부위는 인간의 경우와 유사하나 외가닥 DNA와 결합할 때 생기는 구조적 변화의 양상은 인간 RPA의 경우와 다르다는 것을 알았다. 또한, SV40 T-ag 과 인간, S.cerevisiae의 RPA70A 의 상호작용을 NMR 을 통해 관측하여 이로부터 두 종의 RPA가 매우 유사하지만 단백질 표면의 성질이 달라 종별 특이성이 나타날 수 있다는 가설을 제기하였다.
