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NMR studies on the interaction of XPF-ERCC1 heterodimer = XPF-ERCC1 복합체의 상호작용에 대한 NMR 연구
서명 / 저자 NMR studies on the interaction of XPF-ERCC1 heterodimer = XPF-ERCC1 복합체의 상호작용에 대한 NMR 연구 / Yun-Jeong Choi.
저자명 Choi, Yun-Jeong ; 최윤정
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2005].
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초록정보

XPF and ERCC1 exist as a heterodimer to be stable and active in cells and catalyze DNA cleavage on the 5’-side of a lesion during nucleotide excision repair. Both XPF and ERCC1 are unstable in mammalian cells when they exist on their own, in the absence of the other partner. To characterize the specific interaction between XPF and ERCC1, we expressed the human ERCC1 Binding domain of XPF (XPF-EB) and the XPF Binding domain of ERCC1 (ERCC1-FB) in Escherichia coli. ERCC1-FB was expressed in inclusion bodies and had to be refolded in the presence of XPF-EB; ERCC1-FB aggregated if XPF-EB was not present in the refolding. Milligram quantities of a heterodimer were characterized with gel filtration chromatography, a Ni-NTA binding assay, and analytical ultracentrifugation. Cross-linking experiments at high salt concentrations revealed that XPF interacts with ERCC1 mainly through hydrophobic interactions. XPF-EB was also shown to homodimerize in the absence of ERCC1. NMR data for the complex showed evidence of proper folding. NMR cross-saturation methods were applied to map the residues involved in formation of the XPF-EB / XPF-EB homodimer and the XPF-EB / ERCC1-FB heterodimer. Helix H3 and the C-terminal region of XPF-EB were either within or in close proximity to the homodimer interface, while the ERCC1-FB binding site of XPF-EB was distributed across helix H1, a small part of H2, H3, and the C-terminal region, most of which exhibited large changes in chemical shift upon ERCC1 binding. The XPF-EB heterodimeric interface is larger than the XPF-EB homodimeric one, which could explain why XPF has a stronger affinity for ERCC1 than for a second molecule of XPF. The XPF binding sites of ERCC1 were located in helices H1 and H3, and in the C-terminal region, similar to the involved surface of XPF. We used cross-saturation data and the crystal structure of related proteins to model the two complexes.

생명체의 유전자는 여러 가지 요인으로 인해 다양한 손상을 입을 수 있고, 이러한 유전자 손상은 자기복제 과정에서 빈번한 돌연변이를 발생시키게 되고, 그 발생 위치에 따라 종양 세포의 발생, 신호전달 체계의 훼손, 세포주기의 비정상적 조절, 세포 사멸의 유도 등의 세포의 기능에 심각한 문제를 양산한다. 그러나, 세포는 이러한 문제를 예방하기 위해 DNA 회복 과정을 통해 유전자의 여러 가지 손상을 정상적으로 복구하게 된다. DNA 손상을 복구하는 주요한 방법 중 하나인 NER (nucleotide excision repair) 는 다양한 DNA 손상 종류를 인식하여 회복시키는 방법이다. 이 과정에서 XPF-ERCC1 단백질 복합체는 DNA 손상의 5’ 쪽을 잘라내는 기능을 한다. XPF-ERCC1 복합체는 DNA 기질로서 bubble, stem-loops, splayed arms 등의 duplex-single stranded의 DNA 접합부위의 구조를 인식하여 자르는 구조 특이 제한효소라고 알려져 있다. XPF는 DNA를 자를 수 있는 nuclease 모티프가 있고, ERCC1 은 그 부분이 없다. XPF는 자체 active site가 있음에도 불구하고 항상 ERCC1과 서로 결합하여야 그 기능을 제대로 한다. DNA 손상회복 결핍을 갖는 색소성 건피증 그룹 F 환자의 경우는 XPF 단백질의 변이를 발견할 수 있고, 이 환자들은 체내에 XPF 뿐 아니라 ERCC1의 양도 낮게 존재한다고 알려져 있다. 이는 XPF와 ERCC1 의 안정성과 그 역할에 있어 적절한 단백질 복합체 형성이 필요함을 나타내는 것이다. XPF-ERCC1 의 결합부분이라고 알려져 있는 도메인들은 2개의 helix-hairpin-helix 이루어 져있는 것으로 예측되어지는데 이러한 모티프가 발견되는 대부분의 다른 단백질들은 XPF-ERCC1의 경우와는 다르게 haipin을 이용하여 DNA와 결합한다고 알려져 있다. 지금까지는 XPF 와 ERCC1 이 어떠한 결합을 하고 있는지, 어떻게 서로 안정화 시키는지에 관해 밝혀져 있지 않았다. 심지어 XPF-ERCC1의 homolog 단백질에 있어서도 그 결합의 특징은 알려져 있지 않았다. XPF와 ERCC1의 어느 부분이 서로 결합 하고 안정화하는데 필요 하는지에 대해 알아보기 위해 XPF-ERCC1 복합체의 구조연구에 대한 연구가 필요했다. NMR을 이용한 구조분석을 하기 위해 재조합 단백질 XPF-ERCC1의 결합 도메인을 많이 얻으려 발현시켰다. 정제된 XPF 부분은 soluble dimer로 GPC, analytical ultracentrifugation을 이용해 확인이 되었고, ERCC1의 부분은 inclusion body로 발현이 되어 6M urea에 녹인 후, 변성상태에서 GPC 를 이용해 정제 하였다. Urea를 제거하기 위해 단계적 dialysis를 사용해 ERCC1을 XPF 존재 하에서 refolding 하였다. 최적화된 refolding 방법을 통해 밀리그램 양으로 단백질 복합체를 얻을 수 있었고, binding assay, GPC 와 같은 방법으로 올바른 refolding 이 되었음을 확인했다. NMR 기법중에 결합부위를 찾는데 가장 정확하다고 알려져 있는 Cross-saturation 기법을 이용해 XPF homodimer의 결합 부위 (3번째 헬릭스와 C-터미날 부분), heterodimer 내에서 XPF의 결합 위치 (첫번째 헬릭스, 두번째 헬릭스에서 조금, 세번째 헬릭스, C-터미날 부분), 그리고 ERCC1의 결합위치 (첫번째 헬릭스, 세번째 헬릭스, C-터미날 부분)를 찾게 되었다. 이러한 결과는 XPF가 왜 honmodimer보다 ERCC1과의 heterodimer를 선호하는 지에 대해 설명할 수 있으며, 이 선호도는 첫번째 헬릭스에 있다고 말할 수 있었다. 그리고 XPF-ERCC1에 대한 cross-linking 실험을 salt 농도 별로 해본 결과 hydrophobic 결합이라고 밝혀 졌다. 이 연구로부터 얻은 결과인 Cross-saturation 데이터와 단백질 결합부위의 모델링을 접목시켜 특징적 XPF-ERCC1 결합에 대해 이해할 수 있었다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {DCH 05023
형태사항 vi, 100 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 최윤정
지도교수의 영문표기 : Byong-Seok Choi
지도교수의 한글표기 : 최병석
수록잡지명 : "Biophysical characterization of the interaction domains and mapping of the contact residues in the XPF-ERCC1 complex". Journal of biological chemistry,
학위논문 학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과,
서지주기 Includes references
주제 Protein XPF ERCC1 interaction NMR
단백질 상호작용 핵자기공명
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