To identify and understand the event in carcinogenesis, we used dot hybridization to screen for genes that are expressed differentially in a nontumorous human colon and carcinoma tissue originated from a patient. Among these genes, we have identified the human homologue of rat UREBI(upstream regulatory element binding protein) gene, one of the human HECT domain family members, as being up-regulated in colorectial carcinoma tissue and colon cancer cell line. Approximately 11kb gene on chromosome X encodes human UREBI(hUREBI) gene which contains a WWE and a HECT domain known as region mediated thioester complex formation with ubiquitin. Many fundamental processes, including oncogenesis, have implicated HECT domain proteins with ubiquitin ligase activity. The hUREB1 protein is a HECT domain protein whose function is not defined yet. Here, we investigate the function of hUREB1 as a ubiquitn-protein ligase in human colorectal cells. Ectopic expression of the HECT domain of hURB1 reduces the protein level and transcriptional activity of the p53 tumor suppressor, which is abrogated by the deletion in the HECT domain or point mutations in the essential residues of the HECT domain. The ubiquitination and destabilization of p53 is observed in cells treated with the protease inhibitor MG132, implying that the HECT domain of hUREB1 suppresses the transcriptional activity of p53 through a ubiquitin-dependent degradation pathway. Based on the results of Northern blot analysis, RT-PCR and immunohistochemical analyses, the over-expression of hUREB1 is associated with\ colorectal carcinoma. Moreover, protein levels of hUREB1 and p53 were inversely correlated. These findings suggest that hUREB1 can function, at least in part, as a negative regulator of p53 during the colorectal carcinoma progression through the ubiquitination pathway mediated by the HECT domain.
본 연구는 암 특이적으로 발현의 변화를 나타내는 신규유전자를 탐색하여 암화 과정에서의 선별된 유전자의 세포 내 기능을 연구하고자 하였다. 우선 암 특이적으로 발현의 차이를 보이는 신규유전자를 선별하기 위하여 인체 태아간조직 cDAN 라이브러리에서 얻어진 대량의 cDNA 클론들을 대상으로 dot hybridization을 실시한 결과 다수의 신규 유전자들이 암 조직에서의 발현증가를 보임을 확인하였다. 그 신규 유전자들 중 인간 상류조절요소 결합단백질(human upstream regulatory element binding proteinl)은 특히 인체 대장암조직과 세포 주에서 그 발현이 현저히 증가함을 확인하였다. 본 연구에서 선별된 인간 상류조절용소 결합단백질은 X 염색체 상에 위치하며 3,360개의 아미노산으로 구성된 약 350,000 Da 크기의 핵단백질이다. 이 신규 단백질은 하나의 WWE도메인과 카르복실기 말단에 위치한 하나의 HECT 도메인으로 구성되어 있으며 세포 내 기능에 관하여 명확히 알려진 바 없으나 기존의 보고된 마우스 기원의 상류조절요소 단백질(약35kDa크기)이 세포 내 암 억제단백질인 p53의 활성을 저해한다는 보고는 있다. 따라서 본 연구에서는 인간 상류조절요소 결합단백질의 인체 대장암 세포에서의 p53 단백질 활성과의 상관관계를 규명하였다. 그 결과 인간 상류조절요소 단백질의 카르복실기 말단의 HECT 도메인이 p53 단백질의 전사활성을 저해하는데 중요한 부분이며 이 도메인의 활성을 없앤 결손절편이나 불활성 도메인을 처리한 결과 p53 전사활성에 영향을 미치지 못하는 결과를 확인하였다. 이는 HECT 도메인을 포함한 ubiquitin ligase 의 기본 활성인 ubiquitin을 이용한 단백질분해과정이 결정적인 역할을 수행하고 있음을 wmdaudd하고 있으며 이를 인간조절요소단백질의 HECT 도메인을 과발현시켰을 때 p53 단백질의 polyubiquitination이 유도시킴으로서 확인하였다. 또한 인체 대장암 조직에서의 인간 상류조절요소 결합단백질의 과발현을 Northern blot, RT-PCR, 그리고 면역조직염색법을 이용하여 증명하였고 더욱이 인체 대장암 조직에서의 인간상류조절요소 결합단백질과 p53 단백질의 발현은 서로 상반된 관계를 보이고 있다. 이로서 암에서 과발현하는 신규유전자인 인간 조절요소단백질은 적어도 부분적으로 인해 대장암에서 암억제단백질 p53의 억제조절인자로서 역할을 하여 암화 과정에 관여할 것으로 본다.
