A parallel analysis of bio-specific interactions on a surface has required the development of biomolecular interfaces in order to retain the activity and the stability of immobilized biomolecules at high densities. As a novel interface, the unique features of a dendrimer monolayer were characterized for protein-ligand interactions. The kinetic and equilibrium analysis of streptavidin-biotin interactions revealed that the dendrimer monolayer renders the unique structural features in terms of the protein coverage and the binding kinetics for streptavidin-biotin interactions, which seem to stem from the synergistic effect caused by the surface orientation of functionalized biotin ligands and the surface orientation. And the layer of tri(ethylene oxide)-attached, fourth-generation poly(amidoamine) dendrimers, more resistant to nonspecific binding of albumin and serum protein, was synthesized and characterized. The specific binding of avidin to the biotinylated layers approached a surface density of $5.2±0.2 ngㆍmm^{-2}$, showing about 92% of full surface coverage. Next, the dendrimer monolayer was implemented as the interfacing layer for chip-based analyses of protein interactions and post-translational modifications. The monolayer of G4 PAMAM dendrimers was adopted to construct the immuno-affinity surface of an antibody layer with high binding capacity of antigenic proteins and a reliable detection. The affinity-captured protein at the immunosensing surface was subjected to direct on-chip tryptic digestion, and the resulting proteolytic peptides were analyzed by using MALDI-TOF MS. The established detection procedure identified the affinity-captured target protein at the level of around 100 fmol and enabled the identification of target protein in biological samples at the level of 0.1 ng/ml. In addition, a chip-based assay of sumoylation, the process of conjugating small ubiquitin-like modifier (SUMO) to a target protein and mediated by multiple enzymes, was developed. Target substrate was immobilized on a surface-modified glass slide in a microarray format followed by the addition of the reaction mixture for sumoylation, and SUMO conjugation was detected using fluorophore-labeled antibodies. The on-chip sumoylation of target substrate proteins resulted in at least 7-fold higher fluorescence intensities than those of irrelevant proteins. The chip-based assay of SUMO conjugation seems to provide a strategy enabling a high throughput analysis of SUMO conjugation.
생체특이반응을 동시에 대량 분석하는 단백질칩 기술에서 생체분자를 활성과 안정성이 유지되는 상태로 칩 표면에 고정시키는 지지체인 인터페이스의 구성은 필수적이다. 생체특이반응의 선택성과 민감도를 높이기 위해서는 칩 표면에 친수성 및 다수의 반응기를 부여하고 특이적 반응 효율은 높이는 반면 비 특이적 흡착 반응은 줄이는 새로운 인터페이스의 개발이 요구되어 왔다. 이러한 관점에서 새로운 인터페이스로서 덴드리머 단분자막의 반응 특성을 고찰하고, 단백질 상호작용의 다양한 타깃을 동시에 대량 분석하고 규명하는 연구를 수행하였다.
덴드리머 단분자막에서 생체특이반응의 모델인 아비딘-비오틴 상호작용의 반응 효율 및 속도를 연구하였다. 이를 위해 구형의 덴드리머 물질을 칩 표면에 처리하여 단분자막을 얻고 비오틴으로 수식한 후 아비딘의 특이적 결합을 유도하였다. 여타의 단분자막 시스템에 비해 덴드리머 단분자막에서 아비딘의 결합 정도가 매우 높았으며 결합 속도도 2배 정도 높게 나타났다. 이러한 결과를 통해 나노 구조체인 덴드리머 단분자막의 구조적인 특성 - 비오틴 분자의 배향성과 주름진 모양의 표면 구조 - 이 생체특이반응의 효율을 증진시킴을 확인하였다. 이러한 과정에서 반응 단백질의 비 특이적 흡착반응을 줄이고자 덴드리머의 64개 아민기에 트리에틸렌 옥사이드 (tri(ethylene oxide))를 연결시킨 물질을 합성하였다. 이를 칩 표면에서 반응시켜 얻은 인터페이스에서 혈청 및 알부민 단백질에 대한 비 특이적 흡착 현상이 현저히 감소하였으며, 아비딘-비오틴의 상호작용에 대한 반응 효율은 높은 수준 ($5.2 ±0.2 ngㆍmm^{-2}$) 을 유지하였다.
다음으로 덴드리머 단분자막을 이용하여 생체특이반응을 검출하는 센싱 표면을 구성하고 단백질의 상호작용 및 번역 후 수식과정의 타깃 단백질을 대량 분석하는 연구를 수행하였다. 단백질의 상호작용에 의해 타깃 단백질을 분석ㆍ규명하고자 다양한 항체분자로 구성된 단백질칩을 제작하였다. 생체 시료 내의 타깃 단백질을 센싱 표면에 포획하고 직접 단백질 분해효소를 처리하여 생체 시료로부터 분리한 타깃 단백질을 센싱 표면에서 직접 단백질 분해효소를 처리하여 저분자 펩타이드로 분해한 후 질량 분석을 통해 펩타이드의 질량 지도를 얻었다. 타깃 단백질의 펩타이드 질량 정보를 단백질 서열 데이터베이스에서 검색하여 타깃 단백질의 정체를 밝혔다. 이러한 분석 방법에 의해 단백질칩 표면에 선택적으로 분리된 타깃 단백질의 정체를 100 펨토몰 수준까지 확인하였으며, 세포질과 혈청 시료 내에 존재하는 타깃 단백질은 0.1 ng/ml 농도까지 측정 가능하였다. 단백질칩의 새로운 응용 기술로서 단백질의 번역 후 수식과정 중의 하나인 수모일레이션 (sumoylation) - 여러 효소들이 관여하여 SUMO가 타깃 단백질에 수식되는 과정 - 을 칩 표면에서 동시에 대량 분석하는 연구를 수행하였다. 다양한 수모일레이션의 타깃 단백질을 유리 슬라이드 표면에 고정시키고 수모일레이션 반응을 유도하였다. 수모일레이션의 타깃 단백질을 형광물질로 수식한 항체를 이용하여 분석한 결과 수모일레이션에 의해 S/N값이 7 이상으로 높게 얻어졌다. 이러한 단백질칩 기술을 활용하여 수모일레이션의 타깃 단백질을 동시에 대량 분석할 수 있는 방법을 구현하였다.
