The PSD-95 family of PDZ-containing proteins is involved in the organization of synaptic structure through their interaction with several membrane, scaffolding and signaling proteins. The functions of two synaptic proteins, which are associated with PSD-95, were investigated in this study. One is stargazin and the other is insulin receptor substrate p53 (IRSp53). Stargazin, the first transmembrane protein known to associate AMPA (a-amino-3-hydoroxy-5-methyl-isoxazole-4-propionate) glutamate receptors (AMPARs), interacts with PSD-95 through the C-terminal PDZ-binding motif. The stargazin C terminus also contains a consensus sequence for phosphorylation by protein kinase A (PKA). It was tested if C-terminus of stargazin is phosphoryated by PKA and this phophorylation may regulate its interaction with PSD-95. Phospho-specific antibodies reveal that the Thr-321 residue of stargazin is phosphorylated in COS cells and in vivo. Cotransfection of stargazin with the catalytic subunit of PKA dramatically increased phosphorylation level of stargazin in COS cells. Mutations mimicking phosphorylation (T321 D and T321 E) eliminated the interaction of stargazin with PSD-95, which was confirmed by yest two-hybrid assay, in vitro coimmunoprecipitation and coclustering assay. Phosphorylated stargazin showed a selective loss of coimmunoprecipitation with PSD-95 in COS cells and limited enrichment in postsynaptic density fractions of rat brain. These results suggest that phophorylation of the stargazin C terminus by PKA regulates its interaction with PSD-95 and synaptic targeting of AMPARs. The small GTPases Rac1 and Cdc42 are key regulators of the morphogenesis of actin-rich dendritic spines in neurons. However, little is known about how activated Rac l /Cdc42 regulates dendritic spines. Insulin receptor substrate 53 (IRSp53), which is highly expressed in the postsynaptic density (PSD), is known to link activated Racl/Cdc42 to downstream effectors for actin regulation in non-neural cells. Here, I report that IRSp53 interacts with two specific members of the PSD-95 family, PSD-95 and chapsyn-110/PSD-93, in brain. An IRSp53 mutant lacking the C-terminal PSD-95-binding motif shows significant loss of synaptic localization in cultured neurons. Overexpression of IRSp53 in cultured neurons increases the density of dendritic spines, but does not affect their length or width. Conversely, siRNA-mediated knock-down of IRSp53 reduces the density, length and width of spines. In addition, the density and size of spines are decreased by a dominant negative IRSp53 with a point mutation in the SH3 domain and a dominant negative proline-rich region of WAVE2, a downstream effector of IRSp53 that binds to the SH3 domain of IRSp53. These results suggest that PSD-95 interaction is an important determinant of synaptic IRSp53 localization and that the SH3 domain of IRSp53 links activated Rac1/Cdc42 to downstream effectors for the regulation of spine morphogenesis.
PDZ domain을 가지고 있는 PSD-95 family 단백질들은 여러 다양한 단백질들과의 상호 결합을 통해 시냅스 구조 형성에 관여하고 있다. 본 연구에서는 이러한 PSD-95 단백질과 결합하는 stargazin과 IRSp53이라는 두 단백질의 기능에 대해 알아보았다.
Stargazin은 AMPA 글루타메이트 수용체와 결합하는 세포막 단백질로서 C 말단을 통해 PSD-95와 결합한다. Stargazin의 C 말단은 또한 protein kinase A (PKA)에 의해 인산화 될 수 있는 아미노산 서열을 가지고 있는데 본 연구를 통해 stargazin의 C 말단에 있는 321번째 threonine에서 PKA에 의한 인산화가 실제로 일어나는 것을 확인하였다. 인산화를 특이하게 인지하는 항체를 이용하여 rat brain에서도 인산화된 형태의 stargazin이 존재하는 것을 확인하였으며 이렇게 인산화된 형태의 stargazin은 정상 상태일 경우와는 달리 PSD-95와 결합할 수 없다는 것을 yeast two-hybrid assay, coimmunoprecipitation assay 그리고 clustering assay를 통해 확인하였다. 또한 인산화 상태의 stargazin은 PSD에 존재하는 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과들은 stargazin이 PKA에 의한 인산화 과정을 통해 PSD-95와의 결합이 조절되고 또한 AMPA 수용체의 시냅스 수송 또한 조절될 수 있다는 것을 의미한다.
Rac1/Cdc42 GTPase들은 신경세포의 actin-rich structure인 spine의 형성에 중요한 것으로 알려져 있다. 하지만 그들이 어떠한 경로를 통해 작용하는지에 관해서는 많이 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 Rac1/Cdc42의 downstream effector로 알려진 IRSp53이 PSD-95와의 결합하고 이를 통해 시냅스로 수송되며 spine의 구조 형성 및 유지에 중요하다는 사실을 확인하였다. PSD-95와 결합할 수 없는 IRSp53 mutant는 정상 상태의 경우보다 시냅스로 수송되지 못하였고 IRSp53을 신경세포에 과발현 시킨 경우 dendrite의 spine 수가 증가하는 결과가 나타났다. 이와 반대로 small interfering RNA (siRNA)를 이용해 IRSp53의 발현을 인위적으로 억제하였을 경우에는 spine의 수와 크기가 모두 감소하는 결과를 확인하였다. IRSp53의 SH3 domain이 정상적으로 작동하지 못하게 하는 dominant negative에 의해서도 spine의 밀도와 크기가 감소하였다. 이상의 결과를 통해 PSD-95와의 결합이 IRSp53의 시냅스 수송에 중요하고, IRSp53의 SH3 domain이 Rac1/Cdc42에 의해 전달된 신호를 하위 단계로 연결함으로써 spine의 형성 및 유지에 관여한다는 사실을 알 수 있었다.
