Chinese hamster ovary cell (CHO) production of humanized antibody was increased by amplification of cotransfected glutamine synthetase (GS) gene using additional rounds of selection with GS inhibitor methionine sulfoximine (MSX). The highest producer (HP) subclones were isolated from each MSX level and was characterized with respect to antibody production, cell growth rate, cell size and mitochondria content. HP subclones showed variable productivities, copy numbers and cellular characteristics that didn’t increase concomitantly to MSX increase. Generally, low production stability was observed during long-term culture. Presence of selection pressure didn’t prevent the drastic productivity drop observed within 10 generations during the long-term culture. Addition of glutamine enhanced the productivity and higher accumulative antibody yields were obtained in glutamine containing media, compared to the glutamine-free media. Significant decrease of copy numbers was observed, but the productivity decrement was much larger than the copy number decrement. The copy number decrease was only partically responsible for the productivity decrease. To understand the sytogenetic events ralated to Gs amplification system, fluorescence in situ hybridization(FISH) analysis was performed. The amplified antibody genes were located on extended chromosomal regions. The existence of amplified arrays on acentromeric double minute chromosomes was not detected. Unstable chromosomal structures including dicentrics, rings, and extremely long chromosomes were observed indicating that the breakage-fusion-bridge cycle is prevalent in GS-CHO cells. During long-term culture, marker chromosomes were completely lost or their frequency of occurrence is reduced significantly. Possible involvement of(TTAGGG)n sequence in the stabilization of amplified arrays was investigated. However, marker chromosomes with amplified arrays didn't show any detecatable(TTAGGG)n signals at the ends of chromosome, except for the minor cases. During FISH analysis, it was revealed that the overall chromosome content was duplicated in highest producer identified in this study. The polyploid nature of initial producer varied randomly among its progenies after the additional round of gene amplification, indicating severe genetic instability. The frequency of occurrence of the polyploidy was substantial around 25% in the initially screened high producers. Taken together, our data suggest that the low production stability of GS-CHO cells is involved with the numerical imbalance of whole chromosomes and the absence of(TTAGGG)n sequence at chromosome ends.
To evaluate the efficacy of selection strategies for rCHO clones with highly amplified foreign gense rCHO cell lines producing a high level of a chimeric antibody were constructed using dihydrofolate reductase gene amplification by two strategies, a selection based on individual clones and a selection based cell pools. A selection based cell pools required less effort to amplify large numbers of individual parental clones within the pool, but it lost high producing clones during amplification procedure. Although a selection based on individual clones is very labor-intensive, it resulted in higher producing clones. In addition, the inclusion of methotrexate in the first drug selection did not improve the selection efficacy of high producing rCHO cell clones. For large-scale production of recombinant antibodies for in vivo therapy, not only the expression level but also the stability of cell lines is critical. By subcloning and adaptation in protein-free suspension culture, a readily suspened cell line was obtained. The chosen cell line was very stable during long-term culture in the absence of selection pressure and approximately 80% of initial productivity was retained after 22 passages. Using this cell line, approximately 80㎍/mL of antibody was obtained in protein-free suspension batch culture.
중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포에서 인간화된 항체의 생산이 글루타민 합성 효소 (glutamine synthetase: GS) 유전자 증폭에 의하여 증가하였다. 항체 유전자는 글루타민 합성 효소와 함께 트랜스펙션 (cotransfection)되었으며, 1차 선별 후 메치오닌 설폭시민 (methionine sulfoximine: MSX)을 증가시켜 추가로 선별하였다. 각 MSX 수준으로부터 분리한 가장 생산성이 높은 서브클론들은 항체 생산, 세포 성장률, 세포 크기 및 마이토콘드리아 함량에서 매우 다른 변화를 보였다. 각 MSX 수준으로부터 분리한 가장 생산성이 높은 서브클론들의 생산력과, DNA 사본 수, 세포 특성의 변화는 MSX 농도 증가에 동반된 일정한 양상으로 나타나지 않았다. 일반적으로, 낮은 생산 안정성이 장기 배양의 동안에 관측되었다. 선택 압력 (selection pressure)이 가해지더라도 장기 배양 기간 동안에 10 세대 안에 관측되는 격렬한 생산력 감소를 막지 못하였다. 배지 안에 글루타민을 투입하면 생산력이 증가되었고, 글루타민이 없는 배지와 비교하여 더 높은 누적 항체 수확량이 글루타민이 포함된 배지에서 얻어졌다. 상당한 DNA 사본 수의 감소가 관측되었다. 그러나, 급격한 생산력의 감소는 DNA 사본 수의 감소보다 훨씬 감소폭이 컸으며, DNA 사본 수의 감소는 생산력 감소를 부분적으로만 설명할 수 있었다. 글루타민 합성 효소 유전자 증폭에서 일어나는 세포 유전학 사건을 이해하기 위하여 ‘형광 원위치 교잡법’(Fluoresence in situ hybridization: FISH)을 실시하였다. 증폭된 항체유전자는 염색체의 길게 늘어난 지역에서 관찰되었다. 증폭된 유전자 배열이 센트로미어가 없는 쌍미세염색체(acentromeric double minute chromosomes)에 위치한 경우는 발견되지 않았다. 쌍센트로미어(dicentric)염색체, 링(ring) 염색체, 매우 길게 늘어난 염색체 등 불안정한 염색체 구조가 관찰되었는데, 이들은 GS-CHO 유전자 증폭법에서 파손-융합-교량(breakage-fusion-bridge)주기가 광범위하게 일어나고 있음을 의미한다. 장기 배양 기간 동안에 증폭된 유전자를 가진 표지 염색체는 완전하게 손실되거나 또는 검출빈도가 상당히 감소하였다. 증폭된 유전자 배열의 안정화에 미치는 (TTAGGG)n서열의 역할을 조사하였다. 하지만, 극히 일부부의 경우를 제외하고는 증폭된 유전자 배열을 가진 표지 염색체들은 어떤 검출 가능한 (TTAGGG)n서열도 염색체 말단에 가지고 있지 않았다. 형광 원위치 교잡법을 통하여 본연구에서 얻어진 가장 높은 생산성을 가진 세포주에서 전체 염색체 수가 배로 증가함이 관찰되었다. 초기에 선별된 세포주의 염색체 배수성(polyploidy)은 이후의 추가 유전자 증폭을 거친 자손 세포주에서는 무작위적으로 변화하였음이 관찰되었으며, 이는 심각한 유전적 불안정성을 의미한다. 1차 선별된 높은 생산성을 가진 세포주중에서 약 25%의 비율로 염색체 배수성이 일어낫다. 종합적으로, GS-CHO 세포의 낮은 생산 안정성은 전체 염색체의 수적 불균형 및 염색체 말단에 (TTAGGG)n 서열의 부재와 관련되어 있음을 본 연구에서 얻어진 데이터로부터 제안할 수 있었다.
높게 증폭한 외래 유전자를 지닌 재조합 CHO 세포의 선별 전략을 평가하기 위하여 다이하이드로폴레이트 환원 효소(dihydrofolate reductase) 유전자 증폭법을 사용하여 카이메릭 항체의 생산 세포주를 제조하였다. 사용된 선별 전략은 개별 클론(clone)에 기초한 방식과 세포 풀(pool)에 기초한 방식의 두가지였다. 세포 풀에 기초한 방식은 많은 수의 클론을 증폭시키는데 노동력이 적게 소요되었으나. 증폭 과정에서 높은 생산성을 가진 클론을 잃어버렸다. 반면, 개별 클론에 기초한 방식은 노동력 집약적인 방식이나. 결과적으로 높은 생산성을 가진 클론이 얻어졌다. 선별 효율을 높이기 위해서 초기에 메소트렉세이트(methotrexate-MTX)를 포함시켰으나, 높은 생산성을 가진 세포주의 선별 효율이 개선되지는 않았다. 인체용 치료 항체의 대규모 생산을 위해서는 항체의 발현 수준뿐만 아니라 세포주의 생산 안정성이 매우 중요하다. 무단백질 현택 배양에서의 서브클로닝(subcloning)과 적응을 통하여 쉽게 부유배양이 되는 세포주가 얻어졌다. 선택된 세포주는 선택 압력의 없는 장기 배양의 동안에 아주 안정하였으며, 처음 생산력의 대략 80% 수준을 22 세대후에도 유지하였다. 이 세포주를 이용하여 대략 80㎍/mL수준의 항체 생산이 무단백질 현탁 배양에서 얻어졌다.
