[ Part I ] Angiogenesis, the formation of new capillaries from pre-existing vessels, is essential for tumor growth and metastasis. Apolipoprotein(a) [apo(a)] contains tandemly repeated kringle domains that are closely related to plasminogen kringle 4, followed by a single kringle 5-like domain and inactive protease-like domains. Recently, the anti-angiogenic activities of apo(a) have been demonstrated both in vitro and in vivo. However, its effects on tumor angiogenesis and the underlying mechanisms involved have not been fully elucidated. To evaluate the anti-angiogenic and anti-tumor activities of the apo(a) kringle domains and to elucidate their mechanism of action, the last three kringle domains of apo(a), KIV-9, KIV-10, and KV, were expressed in Escherichia coll. The resultant recombinant protein, termed rhLK68, exhibited a dose-dependent inhibition of bFGF-stimulated human umbilical vein endothelial cell proliferation and migration in vitro, and inhibited the neovascularization in chick chorioallantoic membranes in vivo. To explore the molecular mechanism of rhLK68-mediated inhibition of angiogenesis, the effects - of rhLK68 on extracellular signal regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways were determined. Treatment with rhLK68 inhibited ERK1/2 phosphorylation but did not influence Akt activation. Interestingly, an inhibitor of protein tyrosine phosphatase, sodium orthovanadate, dose-dependently reversed both rhLK68-induced dephosphorylation of ERK1/2 and decreased migration of endothelial cells, whereas rhLK68 showed no significant effects on mitogen-activated protein kinase kinases (MEKs) phosphorylation. These results indicate that inhibition of endothelial cell migration and angiogenesis by rhLK68 may be achieved by interfering with ERK1/2 activation via a protein tyrosine phosphatase-dependent pathway. Furthermore, systemic administration of rhLK68 suppressed human lung (A549) and colon (HCT-15) tumor growth in nude mice. Immunohistochemical examination and in situ hybridization analysis of the tumors showed a significant decrease in the number of blood vessels and the reduced expression of VEGF, bFGF, and angiogenin, indicating that suppression of angiogenesis may have played a significant role in the inhibition of tumor growth. Collectively, these results suggest that a truncated apo(a), rhLK68, is a potent antiangiogenic and anti-tumor molecule.
[ Part II ] The present study was performed to evaluate the application of cDNA of LK68 as possible candidates for gene therapy treatment of colorectal cancer liver metastasis. The murine colorectal cancer cell line, CT26, was transduced ex vivo with LK68 cDNA via retroviral gene transfer, and an experimental model of hepatic metastasis was established by injecting LK68-expressing and control cells into the spleens of BALB/c mice. Expression of LK68 did not affect the growth characteristics and viability of transduced CT26 cells in vitro. LK68 produced from CT26 cells significantly inhibited the migration of endothelial cells in vitro. In vivo, significant suppression of liver metastasis and prolonged survival was observed in mice bearing LK68-expressing CT26 cells, compared to controls. LK68-expressing liver metastases were restricted to smaller sizes, and displayed decreased microvessel density and increased tumor cell apoptosis. These results collectively indicate that LK68 suppresses angiogenesis-dependent progression of prevascular micrometastases to macroscopic tumors and their growth and that anti-angiogenic gene therapy using LK68 is a promising strategy for the treatment of colorectal cancer liver metastasis.
신혈관형성 (angiogenesis)은 암의 성장과 전이에 필수적인 과정이다. 아포리포단백질(a)는 다수의 플라스미노겐 크링글 4 유사 크링글, 플라스미노겐 크링글 5, 그리고 비활성 단백질분해효소로 구성되어있다. 최근 시험관 조건과 생체 내 조건에서 아포리포단백질(a)는 신혈관형성을 억제할 수 있슴이 밝혀졌으나 종양의 성장에 필요한 신혈관형성 과정을 저해할 수 있는지, 또한 그 작용기전에 대해서는 많은 부분이 알려져 있지 않다. 본 연구의 주 목적은 아포리포단백질(a) 크링글에 의한 신혈관형성 억제효능 및 항암효능을 조사하고 그의 작용기전을 밝히는 것이다. 인간 아포리포단백질(a)의 마지막 세 크링글 (KIV-9, KIV-10, KV)을 대장균에서 재조합단백질로 발현하고 이를 rhLK68이라 명명하였다. RhLK68은 시험관 조건에서 bFGF에 의해 유도되는 제대정맥내피세포 (HUVEC)의 증식과 이동을 농도 의존적으로 저해하였으며, 생체 내 조건에서 유정란의 융모막 발생과정에서의 모세혈관 생성을 억제하였다. RhLK68에 의한 신혈관형성 억제기전을 연구하기 위하여, 혈관내피세포의 증식 및 이동에 중요한 역할을 수행하는 ERK1/2와 PI3K/Akt 신호전달체계에 대한 rhLK68의 영향을 조사하였다. RhLK68의 처리는 ERK1/2의 인산화를 저해하였으나 Akt의 인산화에는 영향을 미치지 않았다. RhLK68의 처리는 MEK의 인산화에는 영향을 미치지 않았으나 단백질 타이로신 탈인산화효소의 억제제인 orthovanadate는 rhLK68에 의한 ERK1/2의 탈인산화와 혈관내피세포의 이동억제를 저해하였다. 이 결과는 rhLK68은 단백질 타이로신 탈인산화효소를 통한 ERK1/2의 인산화를 저해함으로써 혈관내피세포 이동 및 신혈관형성을 억제한다는 것을 나타낸다. RhLK68의 전신성 투여는 면역결핍 생쥐에 이종이식한 인간의 폐암(A549) 및 대장암(HCT-15)의 성장을 억제하였다. 종양조직을 면역화학적 방법 등으로 분석한 결과 종양 내 혈관의 수의 현저한 감소와 angiogenin, bFGF, VEGF 등의 혈관생성 유도인자의 발현 감소가 관찰되었는데 이는 rhLK68에 의한 신혈관형성 억제가 종양의 성장을 저해하는데 중요한 역할을 수행한다는 것을 말한다. 이상의 결과를 종합하면 아포리포단백질(a)의 크링글 유도체인 rhLK68은 강력한 신혈관형성억제 효능과 항암효능을 갖는 물질임을 나타낸다.
본 연구의 또다른 목적은 LK68의 전이억제 효능을 연구하는 것으로, LK68를 이용한 유전자치료법에 의해 결장암의 간 전이를 억제할 수 있는지를 조사하였다. 생쥐의 결장암 세포주인 CT26에 레트로바이러스를 이용하여 LK68 cDNA를 전달, 발현을 유도하였으며, 간 전이의 실험동물 모델은 대조군과 LK68을 발현하는 CT26 세포주를 BALB/c 생쥐의 비장에 주입하여 확립하였다. LK68의 발현은 시험관 조건에서 CT26 세포주의 성장이나 생존에는 영향을 미치지 않았으나, CT26 세포주로부터 생산된 LK68 단백질은 시험관 조건에서 혈관내피세포의 이동을 현저하게 저해하였다. 생체 내 조건에서 LK68을 발현하는 CT26 세포주를 이식한 생쥐는 대조군에 비해 간 전이가 현저히 감소되었고 생존율이 향상되었다. LK68을 발현하는 간 전이는 주로 혈관형성에 의존하지 않고 증식 가능한 작은 크기 (<0.2 mm)로 존재하였고, 단위면적당 혈관 수의 감소와 암세포의 세포사멸의 증가를 수반하였다. 이 결과는 LK68은 혈관형성이 되기 이전의 미세전이가 신혈관형성을 통하여 거대 전이암으로 발전하는 과정을 억제한다는 사실을 나타내며, 결론적으로 LK68을 이용한 유전자치료법 등은 결장암의 간 전이에 유용한 치료법이 될 수 있음을 시사한다.
