The influences of L-amino acids on the cell growth and protein expression were investigated through the cultivation of E. coli W3110 in the media containing L-amino acids of various compositions and concentrations.
In the media with 20 L-amino acids of 0.03g/L concentration before the exhaustion of 20 L-amino acids, the specific growth rate of cell, $0.906h^{-1}$, was higher than that in the minimal media without L-amino acids, $0.6h^{-1}$. But after the exhaustion of added L-amino acids, the specific growth rate, $0.492h^{-1}$, was lower than that in the minimal media, $0.6h^{-1}$. The optimal cell yield per unit glucose, 0.488 g/g, was obtained when 20 L-amino acids of 0.03g/L concentration were supplemented to the minimal media. This cell yield value was higher than that in the minimal without 20 L-amino acids, 0.445g/g. This demonstrates that considerable amounts of compounds serve as the carbon source. Also this value was higher than those in the abundant media containing 0.05g/L and 0.1g/L 20 L-amino acids, 0.450g/g and 0.402g/g, respectively. This result was obtained because the acetate was produced more in the media with more 20 L-amino acids.
Among 20 L-amino acids, the only glycine could improve the specific growth rate of cell. When 20 L-amino acids mixture of 0.03g/L concentration were supplemented to the minimal media, R/2 media containing glucose, the specific growth rate between 3hour and 4hour suddenly decreased. The exhaustion of glycine had the most effect on this phenomenon.
L-valine inhibited the cell growth by obstructing the synthesis of L-isoleucine. When L-valine above 0.00005 g/L was added individually, the time of lag phase was lengthened. But after a certain period, the cell growth (growth rate, $Y_{X/S}$, and $Y_{ace/X}$) was similar with that in the media without L-valine. In other words the cell growth could be restored by itself. The more L-valine was added, the longer the time of lag phase was. But at the concentration above 0.01g/L, the time of lag phase didn’t be prolonged though the L-valine was added more. The growth inhibition by L-valine was overcome by L-isoleucine when the L-isoleucine of amount which remained in the media after the exhaustion of L-valine was supplied. But when L-isoleucine was supplied as 10% amount of L-valine, the cell growth was inhibited by L-valine after the exhaustion of L-isoleucine. Also after a certain time, there wasn’t the restoration by itself, which appeared in the media with the only L-valine.
L-cysteine inhibited the cell growth by operating as the inhibitor of threonine deaminase. The more L-cysteine was added, the lower final cell concentration was obtained and the longer time of lag phase was. Among 20 L-amino acids, L-cysteine have the most effect on acetate production by the cell. When 19 L-amino acids of 0.03g/L concentration (except L-cysteine) were added, the $Y_{ace/X}$, 0.168g/g, decreased up to 30% in comparison to that in the media with 20 L-amino acids of 0.03g/L concentration, 0.239g/g. Also in the shake-flask cultures, the more L-cysteine was added, the higher $Y_{ace/X}$ was obtained.
When the abundant media containing 20 L-amino acids was used for the cultivation of E. coli W3110, the asparaginyl -tRNA synthetase (E.C 6.1.1.22) which was expressed by the E. coli W3110 in the minimal media couldn’t be expressed. Also the proteins related to the synthesis of L-tryptophan (tryptophan synthase α chain (E.C 4.2.1.20) and anthranilate synthase component Ⅱ (E.C 4.1.3.27)) were expressed less than in the minimal media.
These results stated above shows the influences of L-amino acids on the cell growth and protein expression.
대장균은 재조합 단백질을 생산하는 산업에서 널리 이용되는 균주이다. 대장균을 이용하여 재조합 단백질을 생산할 때 재조합 단백질의 생산성을 높여주기 위해서 peptone 이나 yeast extract 같은 물질을 첨가한다. 이 물질들은 가수분해 등의 방법으로 단백질을 분해하여 얻은 펩타이드나 아미노산으로 구성되어 있다. 재조합 단백질의 생산성은 peptone 이나 yeast extract 같은 물질을 포함하고 있는 복합배지에서 높다. 이 것은 peptone 이나 yeast extract 같은 물질 속에 탄소원, 질소원 그리고 단백질의 구성체로 사용 될 수 있는 아미노산이 들어있기 때문이다. 몇몇의 아미노산이 재조합 단백질의 생산성을 개선하기 위해서 대장균 발효 공정에 첨가되기도 한다. 그러나 이렇게 peptone, yeast extract와 아미노산 등이 재조합 단백질 생산 공정에 이용되지만 이 물질들이 어떻게 생산성을 높일 수 있는지에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있다. 그래서 아미노산이 대장균에 어떠한 영향을 미치는지 세포 성장과 단백질 발현 측면에서 연구하였다. 아미노산이 대장균에 미치는 영향을 알아보기 위해서 다양한 조성의 아미노산을 포함한 배지를 가지고 대장균의 플라스크 발효와 회분식 발효를 수행하였다.
0.03g/L의 20가지 아미노산을 배지에 첨가했을 때 대장균은 아미노산이 고갈되기 전후로 두 번의 지수성장곡선을 나타냈다. 아미노산이 고갈되기 전의 비성장속도는 약 $0.9h^{-1}$ 이었다. 이 값은 아미노산이 첨가되지 않은 R/2 배지를 사용했을 때의 것 $0.6h^{-1}$ 보다 높았다. 아미노산이 고갈되고 일정시간이 지난 후에 대장균의 비성장속도는 $0.5h^{-1}$ 로 초기의 비성장속도 보다 낮았다. 또한 이 값은 R/2 배지의 $0.6h^{-1}$ 보다 낮았다. 0.03g/L의 20가지 아미노산을 포함한 배지를 사용했을 때 포도당당 세포 수율이 최적이었다. 이는 공급해 준 아미노산이 탄소원 등으로 세포 질량에 기여했음을 말해준다. 더 많은 아미노산을 공급했을 때 (0.05g/L 와 0.1g/L의 20가지 아미노산) 수율이 0.03g/L를 공급했을 때보다 낮았다. 이것은 아미노산을 많이 공급할수록 아세트산이 많이 생산되는 현상과 관련이 있다.
20가지 아미노산 중 오직 glycine만이 세포 성장 속도를 개선하는 효과를 나타냈다. 0.03g/L의 20가지 아미노산을 공급했을 때 배양 3-4시간에 나타난 비성장속도의 감소는 glycine의 고갈이 주 원인이었다.
L-valine은 L-isoleucine합성을 방해한다 . 그러므로 L-valine이 홀로 첨가되었을 때 대장균의 성장은 억제된다. 하지만 일정시간이 지난 후 대장균은 L-valine을 첨가하지 않았을 때와 같은 성장곡선을 나타냈다. 즉 L-valine은 대장균의 lag phase만을 연장시켰다. 이는 L-valine이 더 이상 L-isoleucine합성의 억제자 역할을 하지 못하거나 L-isoleucine을 합성하는 새로운 방법이 생겼을 것을 추측하게 한다. L-valine의 첨가량을 증가시킬수록 대장균의 lag phase는 길어졌다. 하지만 일정 농도 이상의 L-valine (0.01g/L)을 첨가했을 때 lag phase는 더 이상 길어지지 않았다. L-isoleucine 첨가에 의해 L-valine의 성장 억제를 극복할 수 있었다. 하지만 L-isoleucine(0.01g/L)을 L-valine양(0.05g/L)의 20%만 첨가하였을 때는 L-isoleucine이 고갈된 후에 L-valine의 성장 억제를 극복하지 못했다. 또한 이 경우에는 시간이 지난 후에도 스스로 성장 억제를 극복하지 못하고 거의 자라지 않았다. 이 결과는 L-valine에 의한 성장억제를 극복하는 메커니즘이 세포 농도에 따라 다르게 작용할 것이라는 추측을 가능하게 한다.
L-cysteine은 L-isoleucine 합성에 관여하는 threonine deaminase의 억제자로 작용하여 세포 성장을 억제한다. L-cysteine을 많이 첨가할수록 대장균 성장의 lag phase는 길어졌고 stationary phase에 도달했을 때의 최종 세포농도는 낮아 졌다. L-cysteine은 20가지 아미노산 중 부산물인 아세트산 생산에 가장 큰 영향을 미쳤다. 배지의 L-cysteine 농도가 높을수록 아세트산은 많이 생산되었다 또 회분식 발효에서 L-cysteine을 제외한 19가지 아미노산을 첨가했을 때의 $Y_{ace/X}(0.168g/g)$ 가 20가지 아미노산을 첨가했을 때(0.239g/g)보다 30% 감소하였다. 이 현상이 최종 세포 농도가 낮은 것과도 관련이 있었다.
20가지 아미노산을 배지에 첨가했을 때 대장균의 단백질 발현도 변하였다. 아미노산을 공급했을 때 asparaginyl -tRNA synthetase은 발현되지 않았다. 또한 Trptophan 합성과 관련된 tryptophan synthase α chain과 anthranilate synthase component Ⅱ는 아미노산을 공급하지 않았을 때보다 적게 발현되었다.
