It was reported that the introduction of hemoglobin genes into the host microorganism enhanced the production of various bioproducts. In this study, bacterial hemoglobin genes from Vitreoscilla stercoraria and Sinorhizobium meliloti were transformed into Streptomyces lividans TK24, and it was observed that the growth rate and secondary metabolites (actinorhodin and undecylprodigiosin) productivity dramatically increased with noticeable changes in organic acids production pattern. These results suggested that the genetic transfer of bacterial hemoglobin genes into S. lividans TK24 might have affected both of its primary and secondary metabolisms. A transcriptional analysis based on reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Northern blot analysis was performed, to monitor the expression of various regulatory genes and antioxidant enzyme genes, and thus to understand the mechanism of the enhanced productivity. The target genes were in the following three groups: pathway specific regulatory genes (actll-orf4, redD, cdaR ); pleiotropic regulatory genes (metK, afsQ1, cutR, afsR, , relA, ppk, phoP, and LysR-type transcriptional regulator orf10) and antioxidant enzyme genes(catA, catB, sodN, and sodF,). It was observed that the introduction of bacterial hemoglobin genes increased the transcription of most of the pathway specific regulatory genes tested. However, it increased the transcription of some of the pleiotropic regulatory genes, but decreased the transcription of the other pleiotropic regulatory genes. catA, the major catalase, was induced by bacterial hemoglobin genes during the early growth and stationary phase and it might have had the main role responsing the oxidative stress.
균사를 형성하면서 자라는 방선균은 2차 대사를 통해 현재 알려진 항생제의 70% 이상을 생산한다. 그러나 이렇게 균사를 형성하는 산업균주의 고농도 large-scale 배양은 산소의 낮은 용해도 때문에 성장 및 생산에 큰 저해를 받게 된다. 이러한 산소 제한문제를 생물학적 측면에서 접근해 보면, 용존 산소를 균주가 효과적으로 이용할 수 있도록 유용한 표현형을 유전자 재조합을 통해 발현시켜주는 방법을 간구할 수 있다. 세포 내로 산소를 전달하는데 탁월한 능력을 가지고 있는 bacterial hemoglobin은 유전자 재조합 방법을 통해 이종균주인 S. lividans TK24에서 발현이 가능하며, 본 연구에서는 산소 이용능을 증가시키기 위하여 S. lividans TK24에 도입된 두 bacterial hemoglobin 유전자 (vhb and fhb) 가 균주의 대사물질 생산과 조절 유전자 발현 양상에 끼치는 영향에 대하여 조사하였다.
회분식 배양에서 두 bacterial hemoglobin 유전자를 재조합한 VHB 와 SM 균주는 vector만 갖은control 균주에 비하여 성장과 기질 소모 속도가 증가 했을 뿐만 아니라 유기산의 생산 증가와 함께 2차 대사산물(Actinorhodin and Undecylprodigiosin)의 생산성이 2~4배이상 증가하는 결과를 보였다. 향상된 성장과 생산성의 기작을 이해하기 위하여 조절유전자들의 발현을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 조절 유전자들의 종류는 다음과 같다; pleiotropic regulatory genes (afsR, afsQ1, relA, LysR-type transcriptional regulator orf10, cutR , ppk, and phoP), pathway specific regulatory genes (actll-orf4, redD, cdaR ), and antioxidant enzyme genes (sodN, sodF, catA and catB). pleiotropic regulatory 유전자들은 향상된 성장 속도와 함께 전체적으로 일찍 발현을 시작하여 늦게 까지 발현이 유지되는 경향을 나타냈다. pathway specific regulatory genes의 발현 양상이나 양은 2차대사 산물의 생산량과 정확하게 일치하지는 않지만, 전반적으로 같은 양상을 보이며, 이는 2차 대사 산물의 생산이 pathway specific regulatory의 발현 보다는 생합성 유전자의 발현과 상관관계가 있는 것으로 사료되어진다. 또한 antioxidant enzyme genes 중 특히, catA 가 재조합 균주에서 빠르고 지속적인 유전자 발현 양상을 보이는 것은 빠른 성장에 의해 생성된 radical을 제거하는 작용 양상과 일치하는 결과를 보인다. 이러한 결과는 catA 가 bacterial hemoglobin 도입에 의해 유도된 과도한 oxidative stress에 반응하는 유전자임을 나타낸다. 마지막으로 Northern blot analysis를 수행하여 유전자 발현이 RT-PCR 에서와 같은 양상을 보이는 것을 확인하였으며, 이는 본 연구에서 수행한 RT-PCR 분석을 재확인 및 보완해 주는 의미를 갖는다.
