Bacteriorhodopsin (BR) is a light-sensitive protein in the purple membrane (PM) of Halobacteria salinarium living in salty environments and is currently considered as a promising candidate material in the design of molecular electron device and optical computers. Recently, it has been researched vigorously cause of these potentials
In this study, optimum fermentation condition of Halobacteria salinarium and efficient production of Bacteriorhodopsin (BR) were researched. First of all, screening of cells highly producing BR was carried with antibiotics such as Lovastatin and Novobiocin. In case of Lovastatin, $10^{-7}$ M was reported as optimum concentration. Cells with Lovastatin produced BR more than control at 2 folds, and yield was constant until $5^{th}$ succeeding culture at $10^{-7}$ M. In case of Novobiocin, there was no difference in yield. However, optimum concentration was shown from $0.078 x 10^{-6} M to 0.078 x 10^{-7}$ M.
After cell screening, optimum fermentation condition was examined. In this study, relations of dissolved oxygen concentration to cell growth and BR synthesis were examined. As a result of flask culture, high aeration (250 rpm) was favorable to cell growth and low aeration (150 rpm) was favorable to BR synthesis. In case of Batch culture, relation of specific growth rate, $μ (h^{-1})$ and dissolve oxygen concentration, D.O. was examined. As a result, cells needed D.O. concentration over 0.005 mmol/L and cells highly produced BR at 0.05 mmol/L. Cells produced red membrane rather than purple membrane over 0.05 mmol/L. Also, optimum oxygen transfer condition was examined measuring $k_La$ and Oxygen Uptake Rate with dynamic method. $k_La$ and OUR were measured at $40 h^{-1]$ and 6.5 mmol/g dw-h in changing states of rpm and air flow rate.
After setting optimum D.O. condition, efficient purification method of BR was examined with condensation methods such as aqueous two phase system and ammonium sulfate precipitation. After condensation, modified sucrose density gradient (17,000 rpm & 2 hours) was applied and compared to conventional method (45,000 rpm & 15 hours). As a result, there was no remarkable difference in purity $(λ_{280nm}//λ_{568nm}$ were measured at 2.01 and 2.13, respectively compared to $λ_{280nm}/λ_{568nm} ≤2.1$ as a standard). Although yields (34 % of aqueous two phase system and 39 % of precipitation) were less than conventional method (50 %), ultra centrifugation was not needed in case of modified methods. Thus, saving of lead time and cost can be expected in bio-processing of BR.
광생물 전자 소자(光生物 電子 素子)로 주목 받고 있는 박테리오로돕신(Bacteriorhodopsin)을 대량 생산하기 위한 연구를 수행하였다. 우선 박테리오로돕신의 생산성이 좋은 Halobacteria salinarium 균주에 대한 탐색이 이루어졌으며 고체 배지와 Lovastatin (or Mevalonate) 또는 Novobiocin과 같은 Antibiotics를 사용하여 Cell screening 작업이 이루어졌다. Lovastatin의 농도가 $10^{-7}$ M 일 때 5 번째 계대 배양을 한 상태에서도 박테리오로돕신의 수율은 변하지 않았으며 항생제 처리를 하지 않은 것에 비해서 약 2 배 이상 높게 나타났다. Novobiocin의 경우는 항생제 처리를 하지 않은 것과 비교했을 때 수율에 있어서 별차이는 없었으나 최적 농도는 $0.078 x 10^{-6}$ M에서 $0.078 x 10^{-7}$ M인 것으로 나타났다.
박테리오로돕신 생산 균주를 선별한 후, 최적 배양 조건에 대한 연구가 이루어졌다. 여기서는 용존 산소 조건과 균주의 성장, 그리고 박테리오로돕신의 수율에 관한 연구가 이루어졌다. Flask culture를 통해서 균주 성장에 있어서는 강한 aeration (250 rpm)이 필요하여 수율에 있어서는 낮은 aeration (150 rpm)이 적합함을 알 수 있었다. 그리고 Batch culture를 통해서 Specific growth rate 와 용존 산소량의 상관관계를 파악한 뒤, 균주의 성장에 있어서는 0.005 mmol/L 이상의 산소농도를 필요로 하며 수율에 있어서는 0.05 mmol/L 가 최적 농도임을 밝혀 내었다. 0.05 mmol/L를 넘어갈 경우 Purple membrane 생성이 아닌 Red membrane 생성으로 배양이 진행되었다. 또한 최적 산소 전달 조건을 알아보고자 $k_La$ 값을 rpm 과 공기 유량을 달리한 상태 (400 rpm & 0.5 vvm, 350 rpm & 0.5 vvm, 400 rpm & 1vvm) 에서 Dynamic method를 사용하여 측정한 결과 약 $40 h^{-1}$ 으로 나타났다. 그리고 Halobacteria salinarium의 산소 섭취 속도 (OUR)에 대한 측정이 진행되었다. 마찬가지로 Rpm과 유량을 조절하면서 48 시간 이후의 OUR을 측정한 결과 약 6.5 (mmol/g dw-h)로 나타났다.
박테리오로돕신의 분리 정제에 있어서는 수성이상계(水性異常系)와 암모늄 침전법(沈澱法)을 중간 농축 단계로 사용한 뒤에 수정된 Sucrose density gradient (17,000 rpm & 2 hours) 방법을 사용한 후 기존의 방법 (45,000 rpm 15 hours)과 수율과 순도에 있어서 비교를 하였다. 그 결과 순도에 있어서는 각각 100, 98, 100 %로 별 차이 없이 나타났으며 수율에 있어서는 34, 39, 50 %로 수정된 방법이 낮게 나타났다. 그러나 장시간 원심분리를 할 필요가 없고 초원심분리기와 같은 고가 장비가 필요 없으므로 중간 농축 단계로 수성이상계를 사용한다면 기존 공정보다 효과적임을 알 수 있다.
