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Gene delivery system using FOL receptor-mediated endocytosis = Folate 수용체 유도 세포내 전달을 이용한 유전자 전달 시스템
서명 / 저자 Gene delivery system using FOL receptor-mediated endocytosis = Folate 수용체 유도 세포내 전달을 이용한 유전자 전달 시스템 / Kyung-Chul Cho.
저자명 Cho, Kyung-Chul ; 조경철
발행사항 [대전 : 한국과학기술원, 2005].
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Part I For efficient receptor-mediated gene transfection, a new and simple formulation method based on using polyethylenimine (PEI) and folate (FOL)-poly(ethylene glycol) (PEG)-poly(L-lysine) (PLL) conjugate was presented. Luciferase plasmid DNA and PEI were complexed to form slightly positive-charged nanoparticles, onto which FOL-PEG-PLL conjugate was surface coated. With increasing the coating amount of FOL-PEG-PLL conjugate, the FOL-PEG-PLL/PEI/DNA complexes exhibited increased surface zeta-potential values with concomitantly increased diameters, indicating that the PLL part was physically anchored on the surface of preformed PEI/DNA complexes with exposing FOL moieties outside. The formulated complexes exhibited far greater transfection efficiency against FOL receptor over-expressing KB cells than FOL receptor deficient A549 cells. This was caused by enhanced cellular uptake of the resultant complexes via a receptor-mediated endocytosis process. The formulated complexes showed higher gene expression level, even in the presence of serum, than the PEI/DNA or Lipofectamine/DNA complexes. This was attributed to the PEG chains present on the surface of complexes that could work as a protective shield layer against aggregation caused by non-specific protein adsorption. The FOL-PEG-PLL/PEI/DNA complexes also demonstrated better cell viability than the PEI/DNA complexes. Part II Recombinant reversed caspase-3 (rev-caspase-3), a pro-apoptotic gene, is capable of intracellular autocatalytic processing which induces apoptosis, leading to programmed cell death. Folate receptor-specific intracellular delivery of rev-caspase-3 plasmid DNA into folate-receptor over-expressing KB cells was explored using folate-poly(ethylene glycol)-polyethylenimine (FOL-PEG-PEI) conjugate as a novel nonviral polymeric carrier. Using luciferase as a reporter gene, various formulation conditions of DNA/polymer polyplexes were pre-optimized to attain the highest folate receptor-mediated gene transfection efficiency. FOL-PEG-PEI conjugate complexed with rev-caspase-3 plasmid in an optimized condition gave rise to a great increase in expression and activation of exogeneous rev-caspase-3 within KB cells pretreated with doxorubicin. Compared to other transfection agents that are commercially available, the synthesized conjugate exhibited a higher transfection efficiency due to its unique capacity of receptor-specific intracellular gene delivery via folate-receptor mediated endocytosis. The transfected cells showed a significant extent of apoptosis by rev-caspase-3. This study suggests that folate-receptor mediated delivery of rev-caspase-3 could have the potential for suppression of tumor cells over-expressing folate receptors.

Part I 수용체 유도에 의한 유전자 전달은 기존의 방법인 양이온성 고분자 / DNA의 복합체와 음전하를 띠는 세포막과의 비특이적 이온 상호작용에 의한 전달보다 높은 유전자 전달 효율과 함께 특정 조직으로의 표적지향성 또한 기대할 수 있다. 본 연구 에서는 folic acid (FOL)를 리간드로 도입하여 암 세포 특이적 유전자 전달 효율을 높이고, serum 존재 하에서의 안정성을 향상 시키는 polyetyleneglycol(PEG), buffering 효과와 더불어 DNA를 효과적으로 응축시키는 poly(L-Lysine)(PLL) 을 접합시킨 고분자 유전자 전달체인 FOL-PEG-PLL를 합성 하였다. Polyetyleneimine(PEI) 등의 고분자는 buffering 효과를 나타냄으로써 유전자 전달체의 endosome으로부터의 탈출을 도와 산성 환경 하에서의 유전자 손상을 줄일 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 PEI / DNA 복합체를 PEI 아민그룹의 positive charge와 DNA phosphate 그룹의 negative charge의 비(+/-) 가 4가 되도록 formulation해서 약간의 + 전하를 띠도록 pre-condensation시킨 후, 이 복합체에 FOL-PEG-PLL를 coating 하였다. 코팅된 FOL-PEG-PLL 접합체가 적절하게 PEI / DNA 복합체와 상호작용하여 효율적으로 DNA를 condensation 시키는지 확인하기 위해 DNase protection assay를 수행한 결과, PEI / DNA 복합체에 FOL-PEG-PLL가 코팅되었을 때 더욱 복합체를 안정화시켜 DNase 로부터 palsmid DNA를 완전히 protection 하는 것을 관찰하였다. DLS(Dynamic Light Scattering)를 사용하여 FOL-PEG-PLL / PEI / DNA 복합체의 크기를 FOL-PEG-PLL와 DNA의 weight ratio별로 측정하였고, 복합체의 표면 전하는 분광측정법을 사용하여 제타포텐셜(Zeta Potential)을 측정하였다. 그 결과 weight ratio가 1.5일때 복합체의 표면전하는 20 이상이며 그 크기는100 nm 정도로 DNA의 세포 전달에 효율적인 것으로 나타났다. 만들어진 FOL-PEG-PLL/ PEI/ DNA 복합체의 세포내 유전자 전달 효율을 확인하기 위해 reporter 유전자로 pCMV-Luc를 사용하여 FOL-PEG-PLL와 DNA의 weight ratio별로 transfection 효율을 확인하였다. 또한 수용체 특이적 유전자 전달을 확인하기 위해서 folic acid 수용체를 다량 발현하는 암세포주 (KB cells)와 보통의 암세포주 (A549 cells)를 사용하여 비교 실험 하였다. PEI 아민그룹의 positive charge와 DNA phosphate 그룹의 negative charge의 비(+/-)가 4로 고정된 PEI / DNA 복합체에 합성된 FOL-PEG-PLL을 weight ratio 별로 formulation하여 사용한 결과, weight ratio가 1.5일때 folic acid 수용체를 다량 발현하는 암세포주 (KB cells)에서 보통의 암세포주 (A549 cells) 그룹보다 약 50배 정도의 높은 transfection 효율을 나타내었다. FOL-PEG-PLL을 weight ratio를 1.5로 고정하고, DNA phosphate 그룹의 negative charge와 PEI의 아민그룹의 positive charge의 비 (N/P ratio)에 따른 transfection 효율을 확인하였다. 그 결과 DNA / PEI 복합체의 N/P ratio 가 4일 때 FOL-PEG-PLL와 상호작용에 의한 높은 transfection 효율을 나타내었다. 생체내 단백질 존재 환경에서의 FOL-PEG-PLL / PEI / DNA 복합체의 안정성을 확인하기 위해서 Serum이 포함된 배지와 Serum이 포함되지 않은 배지에서 각각의 transfection 효율을 비교 실험 하였다. 그 결과 FOL-PEG-PLL / PEI / DNA 복합체가 serum 존재 하에서 transfection 효율이 5배 정도 낮아졌으나 다른 종류의 고분자 복합체에 비해서 향상된 안정성을 나타내었다. FOL-PEG-PLL 농도에 따른 FOL-PEG-PLL / PEI / DNA 복합체의 cytotoxicity를 MTT assay를 이용하여 확인한 결과 FOL-PEG-PLL 와 DNA 의 weight ratio가 1.5일때 가장 좋은 cell viability를 나타내었다. Part II 암 세포 특이적 유전자 전달 효율을 높이기 위해 folic acid (FOL)를 리간드로 도입하 고, 생체 내 serum 존재 하에서의 고분자 / DNA 복합체 입자의 안정성을 향상 시키는 polyetyleneglycol(PEG), buffering 효과와 더불어 DNA를 효과적으로 응축시키는 polyethyleneimine(PEI)를 접합시킨 고분자 유전자 전달체인 FOL-PEG-PEI를 합성하였다. 양 말단에 N-hydroxysuccinimide (NHS)와 maleimide로 활성화 되어있는 heterofunctional PEG의 한 쪽 말단을 FOL 표면의 아민기에 먼저 접합시킨 후, 다른 한쪽 말단을 PEI backbone 의 아민기에 접합시켰다. 합성된 FOL-PEG-PEI 의 접합여부를 확인하기위해 NMR analysis를 시행하였다. 위에서 합성한 FOL-PEG-PEI 고분자 벡터들을 Reporter유전자인 pCMV-Luc 와 복합체를 형성시킨 후, in vitro transfection protocol에 따라 FOL-PEG-PEI / DNA복합체의 크기와 표면 전하를 바꾸면서 transfection 효율을 측정하였다. 또한 DLS(Dynamic Light Scattering)를 사용하여 FOL-PEG-PEI / DNA 복합체의 크기를 측정하고, 분광측정법을 사용하여 복합체의 표면 전하를 측정하였다. 그 결과 FOL-PEG-PEI / DNA 의 weight ratio 가 1 일 때 유전자 전달이 가장 효율적으로 일어나며, 이때 복합체의 표면전하는 10 정도이고, 그 크기는100 nm 정도로서 DNA의 세포 전달에 효율적인 것으로 확인 되었다. DNase protection assay를 통해, FOL-PEG-PEI / DNA 복합체의 weight ratio 가 1이라는 최적의 formulation condition에서 FOL-PEG-PEI 접합체가 적절하게 안정적으로 DNA를 condensation 시킴으로써 DNase 로부터 palsmid DNA를 완전히 protection 하는 것을 확인하였다. 위에서 얻어진 결과를 바탕으로, 치료 유전자로서 reversed caspase-3 합성 유전자를 이용해 FOL-PEG-PEI 고분자 접합체와 복합체를 만들어 암세포에 전달 할 경우, 수용체 특이적 유전자 전달 기작에 의해서 대조군으로 사용한 고분자 벡터인 PEI나 지질 벡터인 Lipofectamine에 비해 그 치료 효과가 향상됨을 확인 하였고, CaspACE assay system 을 사용해 다른 대조군에 비해 reversed caspase-3의 activity가 증진되었음을 확인하였다. Reversed caspase-3 에 의해 유도된 세포의 사멸은 광학현미경으로 쉽게 확인 할 수 있었으며, 정량적인 확인을 위해MTT assay 와 viable cell counting을 통해서 reversed caspase-3 유전자가 FOL-PEG-PEI을 통해서 세포내로 전달 될 경우 세포사멸의 효과가 약 3배 증진됨을 관찰 하였다. 또한, reversed caspase-3 유전자의 세포내 전달 이후, 부가적으로 함암 약물 치료의 목적으로 광범위하게 사용되는 항암제인 독소루비신으로 세포를 처리한 결과, 세포예정사를 유도하여 그 사멸효과가 향상되었다. PI 염색 후 FACS를 이용한 세포 주기 분석을 통해 전체 사멸 세포 중에서 세포 예정사가 일어난 세포들의 비율을 확인하였고, reversed caspase-3 유전자가 FOL-PEG-PEI을 통해서 세포내로 전달 될 경우, PEI 나 lipofectamine을 사용한 대조군에 비해 세포 예정사가 일어난 세포 비율이 증진됨을 관찰함으로써 세포 사멸의 효과가 reversed caspase-3 유전자의 작용으로 인한 세포예정사의 효과에 의한 것임을 확인하였다.

서지기타정보

서지기타정보
청구기호 {MBS 05020
형태사항 ix, 82 p. : 삽도 ; 26 cm
언어 영어
일반주기 저자명의 한글표기 : 조경철
지도교수의 영문표기 : Tae-Gwan Park
지도교수의 한글표기 : 박태관
학위논문 학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 생명과학과,
서지주기 Includes reference
내용 pt. 1, Folate receptor-mediated gene delivery using folate-poly(ethyleneglycol)-poly(L-lysine) conjugate. - pt. 2, Folate receptor-mediated intracellular delivery of reversed caspase-3 for apoptosis
주제 PEI
folate
receptor-mediated endocytosis
Rev-Caspase-3
Apoptosisrase
Sialyltransferase
DEAE Chromatography
2-D HPLCnjugation
PEI
folate
수용체 유도 세포내 전달
Rev-Caspase-3
세포유도사멸 시알산 전이효소
DEAE 크로마토그래피
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