The primary goal of this research is to examine feasibility of the application of FRET detection method in SUMOylation detection. SUMOylation is one of recently discovered post-translational modification processes, which is adopted by eukaryotic cells to control various important cellular functions. This study is based on the fact that SUMO1(G) as SUMOylation modifier, after SUMOylation would covalently attach to it’s SUMOylation substrates. Human RanGAP1 domain containing SUMOylation motif was used as a model. ECFP fusion human SUMO1(G) was used as modifier and EYFP fusion human RanGAP1 domain as its substrate. Since the constant attachment between this two proteins，in short proximity, fluorescence resonance energy transfer(FRET) might occur between donor ECFP and acceptor EYFP, result in increased fluorescence intensity at EYFP emission region under 400nm ECFP excitation that normally not occur in negative control. As result, FRET occurrence was confirmed by obvious changes in increased fluorescence emission in the emission region of EYFP(510nm~530nm) after background reducing process by membrane filtration. The result enables further application of FRET method in the study of in vivo SUMOylation dynamics, or in combination with high throughput SUMO target screening system.
본 논문은 용액 속 수모일레이션을 형광공명에너지전달을 이용하여 탐지하는 방법에 대해서 기술하고 있다. 수모일레이션은 최근에 발견된 단백질 합성 후 변형과정 중의 하나로 다양한 세포의 기능을 조절하기에 매우 중요하다. 본 논문의 기본적인 원리는 수모 단백질은 수모일레이션과정 중 수식자의 역할로 수모일레이션의 기질 단백질과 공유결합으로 결합이 된다는 사실을 기초로 하고 있다. 본 논문에서 사용한 수모일레이션 모델 시스템에서는 RanGAP1의 수모일레이션포함 도메인이 기질로서의 역할을 한다. ECFP 퓨젼 수모 와 EYFP 퓨젼 RanGAP1 을 각각 수식자와 기질로 사용하였다. 이 두 단백질이 수모일레이션 메카니즘에 의하여 공유결합을 형성하게 되며 이들 사이의 거리가 공조에너지전달이 일어 날수 있는 이론적인 거리 값에 들어갈 수 있기에 형광공조에너지전달이 일어나는 것을 기대할 수 있다. 결론적으로 수모일레이션 후 400nm ECFP 활성화 하였을 때 관찰할 수 없었던 EYFP 형광영역(510nm~530nm 파장)에서 형광이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
본 논문을 통하여 수모일레이션을 FRET 방법을 통하여 측정할 수 있는 기초적인 접근방법을 제시하였으며, 비록 생체 밖에서 확인한 결과이지만 향후의 생체 내 수모일레이션을 동적으로 관찰하는 데 적용하거나 생체 밖에서 동시대량 분석 시스템과 결합하여 편리하고 민감도가 높은 탐지시스템으로 적용할 가능성을 제시하였다.
