Biocatalytic resolution has drawn much attention to obtain enantiomerically enriched compounds by exploiting the selectivity of enzymes for one form of the enantiomers of a racemic molecule. The development of efficient enzyme systems and processes has been an important research objective in this field. In this thesis, I carried out development of novel cell surface displayed systems for the production of enatiomerically pure compounds.
First, recombinant Escherichia coli displaying lipase on the cell surface was examined as a whole cell biocatalyst for enantioselective resolution of racemic compounds. The Pseudomonas fluorescens lipase was displayed on the cell surface of E. coli by fusing the lipase gene to the Salmonella typhimurium outer membrane protein C (OmpC) gene by Cterminal deletion-fusion strategy. When racemic ethyl 3-hydroxybutyrate, methyl mandelate and cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one were used as substrates, (R)-3-hydroxybutyric acid, (S)-mandelic acid and (3S, 4R)-cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one were successfully obtained with the enantiomeric excess of greater than 99%. The cell surface displayed lipase was found to be maintained without much loss of activity and selectivity during 10 repeated reactions over 120 hours.
Second, a novel cell surface display system was developed employing FadL as an anchoring motif, which is an outer membrane protein involved in long-chain fatty acid transport in Escherichia coli. A thermostable Bacillus sp. TG43 lipase (44.5 kDa) could be successfully displayed on the cell surface of E. coli in an active form by C-terminal deletion-fusion of lipase at the ninth external loop of FadL. Cell surface displayed lipase was quite stable even at 60℃ and 70℃, and retained over 90% of the full activity after incubation at 50℃ for a week. As a potential application, cell surface displayed lipase was used as a whole cell catalyst for kinetic resolution of racemic methyl mandelate. In 36 h of reaction, (S)-mandelic acid could be produced with the enantiomeric excess of 99% and the enantiomeric ratio of 292.
Third, production of polyhydroxyalkanoates from olive oil was carried out using metabolically engineered Escherichia coli by displaying the bacterial lipase with FadL as an anchoring motif. To degrade oil during cultivation, constitutively displayed lipase system was constructed, and cell growth and activiy of lipase were studied during the culture. Bacterial lipase was displayed on several recombinant E. coli strains harboring the PHA synthase and enoyl-CoA hydratase for PHA production. When the recombinant E.coli mutants defective in fatty acid pathway were studied, recombinant E. coli fadA mutant WA101 had high PHA concentration of $0.51g l^{-1}$ and PHA content of 9.1 wt%.
Last, the usage of recombinant E. coli displaying lipase on the cell surface was investigated as an enantioselective whole cell biocatalyst. Lipase gene was fused to truncated oprF by C-terminal deletion fusion strategy and truncated oprF - lipase fusion gene was expressed successfully on the surface of E. coli. For the enantioselective resolution, cells were incubated in hexane using racemic 1-phenyl ethanol as a substrate and (R)-phenyl ethyl acetate were successfully obtained with the enantiomeric excess of greater than 96% in 36h reaction.
생체내의 모든 반응은 입체선택성(stereoselectivity)을 지닌 효소들의 촉매작용에 의하여 진행된다. 이들의 입체선택성으로 인해 광학이성질체의 한 형태만이 기질로 사용되어 원하는 작용을 할 수 있게 된다. 이런 기질 특이성(substrate specificity)으로 인하여 생체반응와 관련된 정밀화학제품이나 의약품의 전구체로 사용되는 물질의 키랄성(chirality) 분자의 생산기술이 절실하게 요구되고 있다. 최근의 여러 연구에 의하여 광학혼합물형태(racemic form)의 의약품에서 직접 약리효과를 나타내지 않는 광학이성질체가 약리효과를 방해하거나, 부작용을 초래한다는 사실이 알려지면서 선진국에서는 라세믹의약의 신약 승인을 허용하지 않기 시작하였으며, 이에 따라 광학적으로 순수한 물질을 생산하는 기술이 매우 중요한 기술로 인식되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 광학적으로 순수한 물질을 효율적으로 생산하기 위하여, 입체선택성을 지니는 효소를 세표 표면에 발현하여, 전세포생촉매를 제작하고, 이를 이용하여 광학적으로 순수한 물질을 생산 하였다.
살모넬라 티피무리움 유래의 outer membrane protein C(OmpC)를 표면 발현 모체로 하여 50 kDa의 슈도모나스 유래의 리파이제를 표면발현하였다. 표면 발현은 confocal 현미경과 전세포의 활성을 측정하여 확인하였다. 표면 발현된 리파아제를 이용하여 ethyl 3-hydroxybutyrate, methyl mandelate과 cis-3-acetoxy-4-phenylazetidin-2-one의 라세미 화합물을 광학분할 하였고, 그 결과 99%이상의 광학 순도를 가진 (R)-3-hydroxybutyric acid, (S)-mandelic acid과 (3S, 4R)-cis-3-hydroxy-4-phenylazetidin-2-one를 얻을 수 있었다. 또한 12시간의 반응을 10회 연속으로 수행하였을 때 리파아제의 활성이 80%이상 유지됨을 확인할 수 있었다.
또한, 바실러스 유래의 thermostable 라파아제(44.5 kDa)를 발현 시키기 위하여, 대장균 외막단백질인 FadL을 표면 발현 모체로 선택 하였다. 10개의 세포 바깥쪽 loop중에 N 말단으로부터 9번째 위치의 루프를 단백질을 융합시키는 위치로 선택하여 성공적으로 리파아제를 발현 하였다. 세포 외막 발현을 확인하기 위하여 confocal microscopy와 western blot analysis을 수행하였다. 또한, 세포의 활성과 상등액의 활성을 측정한 결과 세포의 용해 현상은 보이지 않았다. 표면발현된 리파아제는 효소와 유사한 성질인 50℃, pH 9.0에서 가장 높은 활성을 지녔다. 또한 50℃에서 일주일간 활성을 지녀 산업적으로 유용성이 있음을 확인하였다. 광학적으로 순수한 물질을 얻기위하여 라세미 methyl mandelate를 기질로 광학 분할을하여, 36시간의 반응후 99%의 광학순도를 지닌 (S)-mandelic acid를 생산할 수 있었다. 또한 다양한 대장균 균주에 이 세포발현 시스템을 적용하여 대장균이 이용할 수 없는 olive oil을 기질로 하여 MCL-PHA의 생산이 가능함을 확인 하였다.
마지막으로 슈도모나스 유래의 OprF를 표면 발현 모체를 이용하여, 슈도모나스 유래의 리파아제를 대장균에 표면 발현 시켰다. 이 경우 위의 두 시스템에 비하여 다소 떨어지는 활성을 보였으나, 유기용매에서 높은 안정성을 보였다. 따라서, 이점에서 착안하여 Hexane을 용매로 하여 광학분할을 수행하여, 광학 순도가 96.3%인 (R)-1-phenylethyl acetate를 얻을 수 있었다.
