The functional expression of foreign proteins on the surface of bacteria has proved important for numerous biotechnological applications. The outer membrane esterase (EstA) from Pseudomonas putida 3SK is a member of lipolytic autotransporter enzymes which possess an active site defined by the residues GDSL and contain the translocator domain promoting the translocation of the N-terminal passenger domain across gram-negative bacterial outer membranes. We investigated display of a foreign protein, the periplasmic enzyme β-lactamase (Bla), on the surface of Escherichia coli using the translocator domain of EstA. To find out the transport function of a C-terminal domain of EstA, we generated a set of the Bla-EstA fusion proteins containing N-terminally truncated derivatives of the EstA C-terminal domain. The surface exposure of the Bla moiety was verified by whole-cell immunoblots, protease accessibility and fluorescence-activated cell sorting (FACS). The investigation of growth kinetics and host cell viability showed that the presence of the EstA translocator domain in the outer membrane neither inhibits cell growth, nor affects cell viability. Furthermore, the surface-exposed Bla moiety was shown to be enzymatically active. These results demonstrate for the first time that the translocator domain of a lipolytic autotransporter enzyme is an effective anchoring motif for the functional display of foreign protein on the surface of E. coli. This investigation also provides a possible topological model of the EstA translocator domain, which might serve as a basis for the construction of fusion proteins containing foreign passengers. Due to the fact that EstA belongs to a family of lipolytic autotransporter enzymes, we suppose that the β-barrel formed by EstA might be appropriate for surface display of lipolytic enzymes, especially for lipases from related Pseudomonas species. Pseudomonas lipases play an important role in biotechnology both as hydrolases for detergent additives and as synthases catalyzing the kinetic resolution of racemic compounds. Using the EstA translocator domain, we also attempted to display various Pseudomonas lipases on the surface of E. coli. These lipases from P. aeruginosa, Proteus vulgaris, Burkholderia cepacia, and P. fluorescens have characteristic features different from each others such as molecular weight, type of signal sequence, disulfide bond formation, secretion mechanism, and requirement of specific foldases. The surface exposure of each lipase moiety and its functionality were verified by whole-cell immunoblots, protease accessibility, FACS, and whole-cell lipase activity assay. Lastly, we exploited display of lipase library as a highthroughput screening method for the isolation of enzymatically active lipases from large libraries. Using covalent fluorescent lipase inhibitor, functionally active lipase variants were fluorescently stained while inactive ones were not, and these positive clones with fluorescence were isolated by FACS. This approach opens up new perspective in directed evolution of industrially important bacterial lipases.
세포 표면 발현 기술은 살아있는 세포의 표면에 유용한 외래 단백질들을 발현시키는 것으로, 목적 분자의 고친화성 ligand를 탐색하는 polypeptide libraries screening, 구강 면역에 사용되는 live recombinant bacterial vaccines, 새로운 형태의 고정화 효소인 whole-cell biocatalysts, 중금속 등을 제거하기 위한 cell adsorbents 등 매우 다양한 분야에 이용되고 있다. 본 연구에서는 내유기용매성 균주인 Pseudomonas putida 3SK로부터 유래된 outer membrane esterase (EstA)의 C-terminal domain을 anchoring motif로 사용하여 박테리아 표면 발현 시스템을 개발하였고, 다양한 종류의 Pseudomonas lipase들을 활성화 상태로 대장균 표면에 발현시켰으며, 이 표면 발현 기술과 fluorescence-activated cell sorting (FACS)를 이용하여 무수히 많은 lipase 돌연변이 library 중 활성 변이체만을 선별하는 초고속 탐색 방법을 개발하였다.
P. putida 3SK에 존재하는 lipolytic 효소들의 유전자를 탐색하던 중 EstA를 발견하였고, 이것이 새로운 lipolytic 효소 그룹인 GDSL 계에 속하는 autotransporter 단백질임을 알 수 있었다. Autotransporter 단백질은 분비 혹은 세포 표면 발현 시 다른 단백질들의 도움을 필요치 않으며, N-terminal signal sequence, 실제 활성을 나타내는 passenger domain, 이 passenger domain을 세포 외막으로 통과시키는 역할을 하는 C-terminal β-domain으로 구성된다. EstA의 C-terminal domain을 이용한 최적의 표면 발현 시스템을 구축하기 위해 periplasmic β-lactamase (Bla)를 reporter로 하여 다양한 길이의 EstA C-terminal domain을 가지는 재조합 단백질들을 제조하였고, 이를 대장균에 발현시켰다. 재조합 단백질이 발현된 생균의 protease 처리와 FACS 분석을 이용하여 가장 높은 표면 발현률을 보이는 C-terminal domain (EstA β8 domain)을 탐색하였고, 발현된 재조합 단백질 (FP8)이 숙주 세포의 성장과 생존성을 저해하지 않음을 확인하였다. 또 penicillin G를 기질로 사용한 생균 활성 측정을 통해 표면 발현된 Bla가 활성화 상태로 존재함을 밝혔다. 이들 결과를 종합하여 EstA C-terminal domain의 세포 외막에서의 topological model을 제시하였다. EstA가 lipolytic 효소이며 그 유래가 Pseudomonas strain이므로 EstA C-terminal domain에 의해 형성된 β-barrel 구조가 다른 lipolytic 효소들, 특히 Pseudomonas lipase의 표면 발현에 적합할 것이라 예상하였다. 이를 확인하기 위해 서로 간의 생화학적 특성이 다른 다양한 종류의 Pseudomonas lipase, 즉 P. aeruginosa lipase (PAL), Proteus vulgaris lipase (PVL), Burkholderia cepacia lipase (PCL), P. fluorescens lipase (PFL)의 표면 발현을 대장균에서 시도하였으며, 이들 모두 활성화된 형태로 세포 표면에 발현되어 있음을 FACS 분석과 생균 lipase 활성 분석을 통해 밝혔다. 또 lipase 분자내의 active site serine 잔기와 특이적으로 공유 결합하여 lipase 활성을 저해하는 fluorescent lipase inhibitor를 이용하여 활성화 형태의 lipase가 표면 발현 된 세포만을 FACS로 선별하는 library 탐색 방법을 개발하였다. 이 fluorescent lipase inhibitor-lipase 융합체는 lipase에 의한 ester 가수분해에서 관찰되는 tetrahedral intermediate 상태와 유사한 구조를 가지므로, fluorescent lipase inhibitor에 의해 형광 염색된 세포들은 활성화 형태의 lipase를 표면 발현하고 있다고 할 수 있다. 이 방법을 이용하여 foldase-dependent lipase, 즉 효소 활성을 나타내는 구조를 갖기 위해 해당 lipase의 folding을 돕는 specific foldase (Lif)를 필요로 하는 lipase인 PCL을 분자 진화하여 foldase-independent lipase로 개량하였다. 많은 종류의 Pseudomonas lipase들이 foldase-dependent lipase이며 Lif 단백질 없이 발현될 경우 lipase 활성을 보이지 않으며, Lif 단백질이 세포의 내막에 integration 되어 존재하기 때문에 효소의 대량 생산에 어려움이 많다. 개량을 통해 선별된 변이체들 (M3, M5, M7)은 Lif 단백질의 도움 없이도 알맞게 folding되어 lipase 활성을 보였으며, 이들 변이체 모두 219번째 아미노산 잔기가 tyrosine에서 phenylalanine으로 치환되었다는 것을 알 수 있었다. 변이체 중 가장 높은 비활성을 보인 M7는 wild-type PCL이나 다른 변이체와는 달리 Lif 단백질과 같이 발현시켰을 경우 lipase 활성이 크게 변하지 않았는데, 이를 통해 M7에서 치환된 아미노산 잔기들이 lipase 스스로의 folding과 lipase-Lif 간의 상호 작용에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이와 같이 본 연구에서 개발한 lipase 표면 발현 기술과 활성 lipase의 초고속 탐색 기술은 산업적으로 그 의미가 매우 큰 bacterial lipase의 분자 진화에 효과적으로 응용될 수 있는 기반 기술이라 생각된다.
