Lactoferrin (LF) is an iron-binding glycoprotein that is highly found in milk, and also present in exocrine secretions. LF is well known as a multifunctional protein including antibacterial, bactericidal, and antiviral activities. Although LF also functions in the regulation of inflammation and immunomodulation, its mode of action has not been fully elucidated. Previous studies suggested activity of LPS is inhibited by direct binding to LF. However, here we show that when the LPS and purified LF was mixed and formed complex (termed as LF-LPS), it was found to induce production of inflammatory mediators in macrophages to some extent rather than inhibit LPS activity. In this study, we examined the effect of LF-LPS on macrophages and investigated its mechanisms. Nitric oxide and TNF-α were induced by LF-LPS treatment in a dose dependent manner. Also, mRNA level of inflammatory cytokines and chemokines were increased with LFLPS dose dependently. Phosphorylation of MAP kinases was induced, and NF-κB DNA binding activity was increased by LF-LPS treatment. These serial results of activation were mediated by a cellular transmembrane receptor termed Toll-like receptor (TLR) 4: Comparative studies with C3H/HeN and C3H/HeJ mice demonstrated the strong dependency of the LF-LPS signal on TLR4. Production of nitric oxide or TNF-α was not affected by LF in the peritoneal macrophages from C3H/HeJ, a strain of tlr4 -/-. TLR4-dependent IFN-regulated gene 1 (IRG1) gene expression was shown only in RAW 264.7 cells or macrophages those are obtained from C3H/HeN mice.
In addition, when macrophages were pretreated with LF-LPS, cells were rendered a tolerant state to lipopolysaccharide (LPS) challenge. The induction of tolerance by LF-LPS was accompanied by an inhibition of the production of inflammatory mediators, such as TNF-α and nitric oxide. LPSinduced gene expression of inflammatory cytokines IL-1β and IL-6 were also inhibited in LF-LPS-pretreated macrophages. When LF-LPS-pretreated macrophages were challenged with lipoteicoic acid (LTA), a Gram-positive bacterial membrane component, production of nitric oxide and TNF-α were also inhibited. Reduced activity of NF-κB transcription factor DNA binding was caused by increased amount of IκB-α and p50 subunit of NF-κB in LFLPS- induced tolerant macrophages. Although LF-LPS-pretreatment did not affect the gene expression of TLR2 or MyD88, it caused down-regulation of TLR4 gene expression. TLR4-dependent gene expression of IRG1 was also inhibited in LF-LPS-induced tolerant macrophages. Furthermore, prophylactic LF-LPS treatment inhibited the mortality of mice by sepsis. These findings suggest that the immunomodulatory property of LF can be due, in part, to the LPS-binding.
우유의 주 성분으로 발견되는 Lactoferrin (LF) 은 iron-binding glycoprotein으로, 체내 외분비 물질로도 존재한다. LF은 항균, 살균, 그리고 항바이러스성 기능 등의 다양한 기능을 담당하는 단백질로 잘 알려져 있기도 하다. 염증 반응과 immunomodulation의 조절에서도 기능을 담당하지만 아직 그 정확한 작용 기작은 많이 알려져 있지 않다. 이전 실험들에서는 LPS와 LF의 직접적인 결합으로 LPS의 활성이 억제된다고 보고되었다. 그러나 LPS와 정제된 LF을 섞어주어 LF-LPS complex를 형성하였을 때, LPS 활성 억제 보다는 대식세포에서 염증 관련 물질들이 생성됨을 확인할 수 있었다. 이 실험을 통해 우리는 대식세포에서 LFLPS의 효과를 검증하고 작용 기작을 연구하였다. LF-LPS에 의해 대식세포가 활성화 되고 inflammatory mediator의 생성이 증가됨을 확인하였다. Nitric oxide와 TNF-α의 생성량이 처리한 LF-LPS 농도 의존적으로 증가하였다. 또, inflammatory cytokines 및 chemokines의 유전자 발현량 역시 LF-LPS 농도 의존적으로 증가하였다. LF-LPS 의 처리에 의해 MAP kinases의 활성이 유도되었으며, NF-κB 의 DNA 결합 역시 증가되었다. 대식세포 활성화를 보이는 이러한 일련의 결과들은, 세포 표면의 transmembrane 단백질의 하나인 Toll-like receptor (TLR) 4에 의해 전달된다는 사실을 다음과 같은 결과들로 확인할 수 있었다: C3H/HeN과 C3H/HeJ mice를 이용한 비교 실험은 LF-LPS 신호 전달에 TLR4에 매우 의존적임을 보여주었다. LF-LPS을 처리하였을 때, tlr4 -/- 인 C3H/HeJ mice의 대식세포에서는 nitric oxide와 TNF-α의 생성이 영향을 받지 않았다. 그리고 TLR4 의존적인 유전자의 발현은 단지 RAW 264.7 세포나 C3H/HeN mice로부터 얻은 대식세포에서만 유도되었다.
게다가 LF-LPS를 대식세포에 전처리할 경우, 세포가 LPS 자극에 내성 (tolerance) 을 획득한다는 사실을 발견하였다. LF-LPS의 전처리에 의해 내성이 유도된 대식세포에서는 Nitric oxide나 TNF-α와 같은 inflammatory mediator의 생성량이 감소하였다. LPS에 의해 증가하는 IL- 1β와 IL-6 유전자 발현 역시 LF-LPS 전처리 세포에서는 그 양이 억제됨을 확인하였다. 흥미롭게도 Gram-positive bacterial membrane 구성 성분 중 하나인 lipoteicoic acid에 의한 nitric oxide 및 TNF-α 역시 LF-LPS 전처리된 대식세포에서는 그 생성이 억제되었다. LF-LPS 전처리에 의해 증가된 IκB-α와 p50 subunit 단백질 양의 증가는, 감소된 NF-κB의 DNA 결합을 설명해주었다. LF-LPS를 전처리 할 경우, TLR2나 MyD88에 대한 영향은 없는 반면, TLR4의 유전자 발현이 억제되었다. 또한 TLR4 의존적으로 발현되는 IRG1 유전자 발현 역시 억제됨을 확인하였다. 게다가 LF-LPS를 전 처리한 경우 LPS에 의한 패혈증 (sepsis) 으로 야기되는 쥐의 사망률이 감소되었다. 이러한 결과들을 통해 LF-LPS의 immunomodulatory 특성의 일부는 LF과 LPS의 직접적인 binding에 의한 것임을 알 수 있다.
