Influenza A virus promoter is recognized by the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase and directs both transcription and replication of the viral RNA genome. Within the sequence of this promoter, flu strains exhibit a natural unique variation, either a U or a C, at the $4^th$ position from the 3' end. Promoters that contain a C residue (C4 promoter), which are invariably found in genome segments that encode the three RNA polymerase subunits (PB1, PB2, and PA), down-regulate transcription but activate genome replication. Here we have determined the structure of the C4 promoter by NMR spectroscopy and compared it with the structure of the U4 promoter, which was determined previously. The structure of the internal loop in the C4 promoter is similar to that of the U4 promoter. However, the terminal stem of the C4 promoter is strikingly different from that of the U4 promoter. These suggest that the internal loop is important for polymerase binding to the promoter and the terminal stem is crucial for differential regulation of transcription and replication.
An abundant immunogenic peptide encoded by the +1 reading frame of the PB1 polymerase subunit was found by Chen et al. in the course of characterizing viral determinants recognized by mouse CD8+ T cells. This peptide derives from a novel conserved 87-residue protein, PB1-F2, which has several unusual features compared with other influenza gene products in addition to its mode of translation. These include; much more variable level of expression in individual infected cells than other viral proteins; rapid degradation by proteasomes and possibly other proteases; and location in mitochondria. Exposure of cells to synthetic version of PB1-F2 induces apoptosis, and also influenza viruses with targeted mutations that interfere with PB1-F2 expression induce less extensive apoptosis in human monocytic cells than those with intact PB1-F2. This protein has the Arg-rich domain of positive charge and the C-terminal amphipathic helix that are required for membrane translocation. The structural study of this amphipathic helix would propose mechanism of membrane permeation by association with functional cross-section structure.
인플루엔자 A 바이러스는 orthomyxoviridae로서, 8개의 분리된 RNA 유전자를 갖는다. 각 RNA 유전자는 총 11개의 단백질을 발현하며 이중 3개의 RNA는 RNA 중합효소를 이루는 세 개의 단백질 구성요소들의 유전자이다. 8개의 RNA 가닥들은 3’ 과 5’ 말단에 각각 12개, 13개의 보존된 염기서열을 가지는데, 이들은 서로 수소결합을 하는 염기 쌍을 만들어 RNA전사에 영향을 주는 촉진자 (promoter) 역할을 한다. 이 상보적 염기 서열에 의한 수소 결합들은 팬핸들 구조를 가져서 ‘팬핸들 RNA’ 라고 불리기도 한다. Promoter의 3’ 말단에서 4번째 위치하는 염기는 U 또는 C를 갖는 염기서열의 자연 변이가 존재하는데, 자연 변이 Promoter (C4) 가 RNA 전사 또는 복제 과정 중에 영향을 주어, U4 promoter와 비교하여 RNA 전사의 수율이 줄어들고, 복제는 증가시킨다고 보고 되었다. 본 연구에서 핵자기공명(NMR)을 이용하여 C4 promoter의 구조를 결정하고, 염기의 다이나믹스를 관찰하여 U4 promoter와 비교하였다.
U4와 C4 promoter는 공통적으로 비슷한 internal loop 구조를 가지는데 (AA-U) 염기 서열은 특정 수소 결합이 존재 하지 않음에도 불고하고 두 promoter 모두 상당히 비슷한 모습을 보였다. (AA-U) 구조의 특징은 major groove는 상당히 깊어지고, minor groove는 넓어졌는데 이는 RNA 전사과정에서 RNA 중합효소와 상호작용에서 효과적일 것이라고 보고 있다. U4 promoter 와 C4 promoter의 가장 큰 구조적 차이는 이중나선의 말단 구조인데, U4 promoter는 전형적인 상보적 염기 서열과 수소결합으로 안정한 염기 쌍들을 나타내는데 반해, C4 promoter는 A4 염기의 돌출과, 다소 유동적인 수소결합들에 의해 비교적 불안정한 구조를 보였다. 이러한 구조적인 차이는 RNA 전사의 초기 단계에서 RNA 중합효소와의 상호작용에 영향을 주어, 중합효소와 RNA가 이루는 복합체의 구조가 전사 과정에는 불리하지만 복제 과정에서 다소 유리한 것이 유도될 것이라고 설명 할 수 있다. 본 논문에서는 전사과정의 초기 과정을 3부분으로 나누어 promoter와 중합효소가 어떻게 작용하는지를 제시하였다.
인플루엔자의 11개의 단백질들 중에, PB1 중합효소의 유전자로부터 만들어는 다른 단백질이 발견되었다. 이는 면역계에 관련하는 단백질로서 PB1-F2라고 불린다. 아직 많은 기능이 밝혀져 있지 않지만, 주목할 만한 특징으로 이 단백질은 세포내의 미토콘드리아 막을 투과하여 막의 포텐셜을 낮추고 궁극적으로 apoptosis를 유발을 들 수 있다. PB1-F2의 이러한 특징은 인플루엔자 바이러스의 독성이 이로부터 유발되는 것임을 암시한다. 특히 이 단백질에 의한 apoptosis는 면역 계 세포에 집중된다고 알려져 있는데, 이러한 사실은 인플루엔자 감염에 의해 나타나는 면역 세포 감소증과 밀접한 관련이 있다고 볼 수 있다. 최근 PB1-F2 전체 단백질의 기능을 가진 작은 도메인(domain) 부분이 밝혀졌다. 이는 COOH말단 부분으로부터 23개 아미노산으로 구성되며, 이차구조의 예측 결과, 선형의 양쪽성 (amphipathic) 나선 구조를 가지는 것으로 알려졌다.
본 연구에서는, NMR을 통하여 PB1-F2의 3차원 구조를 결정하고자 하였으며, 기능이 같은 작은 도메인의 구조도 결정하여 기능과 구조의 상관관계를 알아내고자 하였다. PB1-F2 전체 단백질은 미토콘드리아의 막과 상호작용 하는 만큼, 수용액에서 용해되지 않아 여러 detergent 와 micelle 들이 사용되었으나, NMR 스펙트럼이 좋지 않아 구조를 계산하는 것이 불가능했다. PB1-F2의 작은 도메인인, PB1-F2-(65-87) 은 30% TFE (trifluoroehanol) 의 수용액에서 NMR 스펙트럼을 얻었으며, 계산을 통해 선형의 양쪽성 나선 구조를 얻었다. 이 도메인의 전체 및 단면의 구조는, 막 구조를 투과하는 여러 단백질의 형태 중 L 형의 범주에 속하는 것으로 ‘Barrel-Stave’ 모델의 막 투과 메커니즘을 따를 것이라고 보고 있다.
