Small noncoding RNAs, broadly defined as non-messenger RNAs with 50 to 500 nucleotides in size, are generated from primary transcripts through processing reactions by various ribonucleases (RNases) in Escherichia coli. Many cellular RNases are participated in this reaction. RNase E, one of the major endoribonucleases, is an endoribonuclease that is essential for cell viability by participating in both RNA processing and degradation. Therefore, substrate discrimination by RNase E is critical for its appropriate action within the cell. M1 RNA, the catalytic component of Escherichia coli RNase P, is derived by 3’ processing from pM1 RNA, a major transcript of the rnpB gene. To elucidate how RNase E discriminates substrate, in this study, cleavage of precursor M1 RNA variants containing various sequences at the rne-dependent site was analyzed with the N-terminal catalytic half of RNase E (NTH-RNase E). The wild-type GAUUU sequence was cleaved most efficiently among the variants. The cleavage efficiency of the UUUUU variant by NTH-RNase E was much less than the in vivo processing efficiency of that variant and for efficient cleavage the retention of single-strandedness at the rne-dependent site was required. Moreover, NTH-RNase E preferred G/C to A/U as the first nucleotide of the rne-dependent site. Kinetic analysis showed that NTH-RNase E displayed both higher $K_m$ and $k_{cat}$ values for more specific substrates.
Although many small noncoding RNAs have been found, most of their biosynthetic pathways remain elusive. Biogenesis of 6S RNA that functions as a modulator of RNA polymerase ($σ^{70}$) activity has been unclear since it was detected 30 years ago. This study showed that there are two different precursors, the long and short ones, which are transcribed from the distal P2 and proximal P1 promoters, respectively. Transcription from the P2 promoter is $σ^S-dependent$, while that from the P1 promoter is not. Both precursors are processed to generate the 5’ end of 6S RNA. The long precursor is processed exclusively by RNase E, an endoribonuclease, while the short precursor is processed by RNase G, another endoribonuclease, as well as RNase E. Therefore, transcription from P2 and subsequent processing of the resulting long precursor by RNase E should be essential to generate 6S RNA in the stationary phase of cell growth. These findings strongly suggest that switching utilization of both sigma factors and endoribonucleases plays an essential role in modulating the level of 6S RNA in E. coli.
Despite the fact that M1 RNA is formed by 3’ processing from pM1 RNA, the biological significance of this reaction is unclear. In this work, a possible role of 3’ end processing was examined using processing defect strains that were constructed by introducing mutations at the rne-dependent site of the chromosomal rnpB gene. The extents of the decrease of the processing efficiency correlated with the decreased cell viability at stationary phase of cell growth. Analysis of 3’ ends of pM1 RNA and M1 RNA showed that pM1 RNA is polyadenylated at the 3’ end, while M1 RNA is not. The pcnB-dependency of stability of pM1 RNA, not M1 RNA suggests that pM1 RNA is degraded by a pcnB-dependent pathway if pM1 RNA is processed to M1 RNA. Therefore, 3’ end processing of M1 RNA may be an essential way to change a fate of the primary transcript from short-lived to long-lived.
Small noncoding RNA (sRNA)는 50에서 500개의 누클레오티드를 가지며 전령 RNA (mRNA)로 작용하지 않는 RNA를 일컫는다. 대장균내의 sRNA들은 일차전사체로부터 여러가지 리보핵산분해효소에 의해 얻어진다. 이때 관여하는 대표적인 리보핵산분해효소인 RNase E는 RNA의 가공과정과 분해과정에 참여함으로써 세포의 생존능력유지를 위해 필요하다.
따라서, 세포내에서의 적절한 기능을 위해서는 RNase E에 의한 기질판별이 필수적이다. 리보자임인 RNase P의 촉매성분인 M1 RNA는 rnpB 유전자로부터 만들어지는 선구 M1 RNA가 3’ 가공과정을 통해 만들어진다. 본 연구에서는 RNase E의 기질판별 기작을 밝혀내기 위해 RNase E인식 부분 (rne-의존위치)의 염기서열이 서로다른 선구 M1 RNA 변이체들을 N-말단 RNase E (NTH-RNase E)의 기질로 사용하여 비교ㆍ분석하였다.
야생형 서열 (GAUUU) 을 가진 RNA는 변이체들중 가장 효율적으로 가수분해 되었지만, UUUUU 서열을 가진 RNA는 생체내에서와는 달리 시험관내에서 보다 비효율적으로 가공과정을 거쳤으며, 단일결합성의 보존이 효율적인 가공에 필요하였다. 또한 rne-의존위치의 첫번째 서열은 G/C 누클레오티드가 A/U 누클레오티드보다 더 선호되었다. 반응속도분석 실험으로부터 NTH-RNase E에 대한 효율적인 기질은 비효율적인 기질들보다 더 큰 $K_m$ 과 $k_{cat}$ 을 보였다.
세포내에서 많은 sRNA들의 존재여부가 확인되었지만, sRNA들의 생합성경로는 제대로 알려지지 않았다. 대표적인 small noncoding RNA중 하나인 $σ^{70}$ 인자에 의존하는 RNA 중합효소의 활성을 저해하는 기능을 가지고 있는 6S RNA는 30년 이전에 184개의 누클레오티드로 이루어진 RNA로 알려져 왔지만, 생합성과정은 제대로 연구되지 않았다. 따라서, 합성과정을 이해하기 위해 endo리보핵산분해효소 돌연변이체들을 이용한 연구를 진행 하였다. 그 결과 6S RNA는 두개의 서로다른 전사촉진유전자들 (P1 과 P2) 로부터 각각 짧은 선구 6S RNA와 긴 선구 6S RNA를 만들어내며, P2로부터 발현되는 긴 선구 6S RNA는 P1과는 달리 $σ^S$ 인자 의존성을 가진다. 이렇게 만들어진 선구체들 중 긴 선구 6S RNA는 전적으로 RNase E에 의해서만 가공되는데 반해, 짧은 선구 6S RNA는 RNase E와 그 유사체인 RNase G에 의해서 가공된다. 따라서, P2에서 전사되는 긴 선구 6S RNA의 RNase E에 의한 가공과정은 생장정지기에서의 6S RNA를 만들어내는데 필수적이라 할 수 있다. 이러한 결과들로부터 서로다른 endo리보핵산분해효소들과 σ 인자들의 엇바꾸기 사용과정은 대장균내에서의 6S RNA의 양의 조절을 위해 필수적이라 할 수 있다.
M1 RNA가 선구 M1 RNA로부터 가공과정을 거쳐 형성된다는 것이 잘 알려져 있지만, 3’ 말단 가공과정의 생물학적 중요성은 명확하게 연구되어 있지 않다. 본 연구에서는 염색체내에 있는 rnpB 유전자의 rne-의존위치에 돌연변이를 도입한 가공과정에 결함이 있는 돌연변이체들을 제작하여 3’ 말단 가공과정의 역할을 규명하고자 하였다. 가공효율의 감소는 생장정지기 세포의 생존능력의 감소와 상관관계를 보였다. 선구 M1 RNA와 M1 RNA의 3’ 말단을 조사 결과로부터 선구 M1는 3’ 말단에 poly(A)서열이 확인된 반면, M1 RNA의 경우는 그렇지 않았다. 선구 M1 RNA의 안정성이 M1 RNA와는 달리 pcnB 의존성을 보였는데, 이는 선구 M1 RNA의 분해가 pcnB 의존적이라 할 수 있다. 따라서, M1 RNA 3’ 말단 가공과정은 반감기가 짧은 일차 전사체를 반감기가 길게 유지되도록 만드는 필수적인 방법이라 할 수 있다.
