The gram-positive, spore-forming bacterium, Bacillus subtilis is known to secrete at least eight extracellular proteases at the end of the exponential phase of growth. Expression of these proteolytic enzymes seems to be tightly regulated and their major function is thought to be the supply of nutrients by degrading extracellular proteins. Most bacterial proteases are synthesized as inactive precursors, or zymogens, to avoid unwanted protein degradation and to regulate proteolytic activity. Every extracellular protease in B. subtilis is synthesized as a preproenzyme in the cytoplasm and is processed to a mature enzyme in the extracellular milieu. The zymogen form of subtilisin is converted to an active form by auto-processing. The processing mechanisms of the most extracellular proteases in B. subtilis have been uncovered.
Extracellular metalloprotease (Mpr) protein might be not able to activate itself. Reportedly, Mpr has very specific substrate specificity, and recognizes a glutamic acid residue as a P1 cleavage site. However a glutamic acid (Glu) residue is not present in the Mpr propeptide cleavage site. For the elucidation of the mechanism of Mpr activation, I tried to construct SB300 (nprE aprE epr) and PB300 (nprE aprE bpr) strains by disruption of epr or bpr gene in B. subtilis DB104 (nprE aprE) each, and overexpressed mpr gene. I observed that when Mpr is overexpressed, its activity is detectable in B. subtilis DB104 (aprE nprE), which lacks subtilisin and neutral protease, but is absent in strains lacking additional proteases. Analysis of Mpr processing in defined protease-deficient mutants by activity assay and Western blot analysis revealed that the extracellular protease Bpr is required for Mpr processing. Pro-Mpr remained as a precursor form in bpr-deficient strains, and glutarnic acid-specific proteolytic activity conferred by Mpr was not activated in bpr-deficient strains. Moreover, I confirmed that Bpr activates Mpr by the propeptide processing through in vitro experiments using purified Bpr. I conclude that Mpr is activated by Bpr.
Because of Glu residue at the propeptide P1 cleavage site of NprB, I tested whether neutral protease B (NprB) is activated by Mpr. Analysis of NprB processing in defined protease-deficient mutants by activity assay revealed that NprB was not activated in bpr-deficient strains. Therefore, I suggest that Mpr, which was activated by Bpr, processed pro-NprB into active form.
Exchange of glutamic acid for serine in the cleavage site of Mpr (S93E) allowed processing of Mpr into its mature form regardless of the presence of other extracellular proteases, including Bpr. In addition, in vitro experiment using purified Mpr (S93E) revealed that S93E mutant is processed by auto-processing. Thus, a single amino acid change is sufficient to convert the Mpr processing mechanism from heteroprocessing into auto-processing.
From this study, I have elucidated the activation mechanism of extracellular proteases in B. subtilis and the exchange of single amino acid alters the activation mechanism of Mpr. It would be interesting to study the regulation of activation mechanism, the role of propeptide for proper folding and substrate recognition pattern of Mpr.
대부분의 단백질 가수분해 효소들은 불활성의 전구체(precursor) 상태로 합성된 후 다양한 활성화 기전 (activation mechanism)을 통해 활성화된다. 본 연구 에서는 Bacillus subtilis의 밝혀지지 않은 extracellular proteas들의 활성화 기전을 규명하고자 하였다.
B. subtilis 168은 모두 8가지의 extracellular protease를 외부로 분비하는 것으로 알려져 있다. 이들 extracellular protease들은 외부로 배출되는 단백질을 분해하여 세포에 아미노산과 같은 영양분을 공급하는 역할을 하는 것으로 추정된다. Bacillus subtilis의 extracellular protease 중 그 활성화 기전이 잘 알려진Apr의 경우 auto-processing으로 활성화가 되며 잘려진 propeptide가 mature form의 folding에 중요함이 밝혀져 있다.
Nonspecific 활성을 보이는 다른 extracellular protease에 비해, extracellular metalloprotease (Mpr)은 glutamic acid specific endopeptidase로 알려져 있어 이 특성을 이용한 활성화 기전 규명 관련 연구를 진행하려 하였다. 특이성을 결정하는 구조를 확인하기 위해 Mpr의 다량발현을 Bacillus subtilis에서 시도하였다. 생산 효율을 높이기 위해 여러 개의 extracellular protease가 제거된 균주에서 전구체 형태의 비활성 단백질을 발현시키려 시도하였다. 그러나 예상 외로, 활성화된Mpr은 extracellular protease가 제거수준이 낮은 균주, DB104 (apr npr)에서만 발현되었다. Mpr은 propeptide의 processing site에 glutamic acid가 없으므로, Mpr의 glutamic acid 특이적 활성 을 고려했을 때 auto-processing에 의해 활성화 될 가능성을 낮은 것으로 판단되었다. 또한 위의 실험에서 사용한 균주들의 genetic difference를 비교하여 Epr 혹은 Bpr이 Mpr를 활성화시키는 데 관여할 것으로 생각하였다.
이를 확인하기 위해 DB104 chromosome에서 각각 epr과 bpr을 gene inactivation시킨 균주 SB300과 PB300을 제조하여 이 균주들에 Mpr을 발현시켰다. Skim milk agar plate를 이용한 protease 활성 측정 결과, Epr은 Mpr의 활성에 영향을 미치지 못함을 확인하였고 Bpr이 제거된 균주들, PB300, DB428, LB700에서 Mpr의 활성이 나타나지 않음을 확인함으로써 Bpr이 Mpr의 활성화에 참여함을 확인할 수 있었다. 또한 SDS-PAGE와 immunoblot analysis를 통해서 Bpr이 pro-Mpr의 propeptide를 자름으로써 mature Mpr로 활성화시키는 것을 확인할 수 있었고, glutamic acid 특이적 활성을 측정한 결과, 생성된 mature Mpr이 활성을 가짐을 확인할 수 있었다. In vitro study를 통하여 Bpr이 pro-Mpr의 propeptide를 잘라 Mature Mpr로 활성화시킨다는 것을 다시 확인하였다. 즉, pro-Mpr은 auto-processing 기전이 아닌, Bpr에 의해 hetero-processing되어 활성화가 됨을 밝혔다.
Mpr이 glutamic acid specific 활성을 보이는 것에 착안하여 cleavage site인 serine 93을 glutamic acid로 point mutaion시킨 Mpr(S93E) mutant를 B. subtilis 각 strain에서 발현시켜 mutation이 Mpr의 활성화에 미치는 영향을 살펴보았다. SDS-PAGE, Immunoblot analysis, glutamic acid specific activity 측정을 통해 S93E mutation으로 인해 Mpr이 auto-processing되는 것을 확인하였고 이 결과는 in vitro study를 통해 다시 확인하였다. 이러한 활성화 기전의 변환을 분자진화론적 견지에서 설명한다면, 초기에 auto-processing이 가능했던 Mpr이 보다 효율적인 효소활성 조절을 위해 다른 단백질 분해효소에 의해 post-translocational 조절을 받는, 현재 형태의 Mpr로 진화되어 왔다고 생각된다.
본 실험을 통해 다른 단백질 분해효소에 의해 활성화되는Mpr의 활성화기전을 규명하였고, single amino acid change를 통해 Mpr의 활성화 기전이hetero-processing에서 auto-processing으로 변화될 수 있음을 보였다.
