In recent years, many attempts have been made to miniaturize complex biochemical analytical process in lab-on-a-chip. Both limit in analytical range and poor accuracy of data have originated from the requirements of each reaction and measurement step. For example, samples with high concentration have been difficulty in measuring the actual concentration because of the narrow measurable range of an analytical instrument. In case of spectrophotometers, they should be used in the region of absorbance 0.4~0.7, because the high absorbance value exceeds the upper boundary of the measurable range.
This thesis has intended to develop a bio-fluidic device, which enable adaptive pretreatment of sample to fulfill an optimal condition of analysis. Using bio-fluidic technique, it would take an advantage that instrument itself responds spontaneously to change the sample with broad range of conditions. Like the automatic gain control of electrical devices, suitable fluidic actuation in sample pretreatment would make improvements, such as expanded domain of acquirable signal and enhanced precision.
In this study, we have developed a bio-fluidic device for optical measurement and sample pretreatment, by an automatic dilution, or a typical pretreatment, which has been required for measurement. To embody automatic dilution, two idea was exploited; dilution with programmable ratio, and to-and-fro mixing. The bio-fluidic device was fabricated in replica molding using PDMS (polydimethylsiloxane). The experimental apparatus consisted of fluid actuating syringe pumps, spectrometer, and personal computer where a VC++ user control program run.
To verify the automatic dilution by bio-fluidic device, red dye solution was used to demonstrate the to-and-fro mixing. In addition, the specific dilution process to reach the target concentration was accomplished. Full mixing required at least 15 times to-and-fros in case of the viscosity 2.095 cp.
Finally, the bio-fluidic device was used to measure E. coli concentrations after sample pretreatments. Generally the optical density, alternative name of absorbance, is proportional to the cell concentration. In high-density cell culture where the optical density increases over several tens, the conventional dilution often causes several disadvantages, such as troublesome from repeated process and inaccuracy from accumulated errors. However, the automatic dilution method showed the high correlation with the conventional procedure. Moreover, the sample volume was reduced from 2 ml to 60 μl. In brief, our device and system can be useful to automate the high-density cell culture.
From the results, our device is able to be applied in several fields: from on-line monitoring of cell concentration in fermenter and water environment monitoring system, to development of lab-on-a-chip system with sample pretreatment function. Furthermore, because of little restriction with fundamental and good performance, adaptive processing due to samples, it is expected to implemented in bio-fluidic systems for various purpose.
최근 복잡한 생화학적 분석 과정을 칩 하나에서 구현하는 것을 목표로 랩온어칩 (lab-on-a-chip)의 개발 및 그 상용화에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 그러나 현재까지 개발된 랩온어칩의 대부분은 칩 상에 구현된 정해진 유체경로를 따라 분석을 수행하기 때문에 다양한 시료를 처리하는 데 한계가 있었다. 즉, 생물화학적 분석을 위해서 거쳐야 하는 반응, 측정 등 여러 단계 각각이 제한조건을 갖기 때문에, 분석할 수 있는 범위에 있어 한계가 있었고, 또한 결과의 정확도도 떨어지는 단점이 있었다. 예를 들어 측정기기 마다 분석할 수 있는 범위가 정해져 있기 때문에 농도범위가 다양한 시료 등을 분석하기 어려웠다.
본 연구에서는 바이오유체기술을 이용하여 사용 분석기기의 최적조건을 만족하도록 시료에 따라 적합한 전 처리를 수행하는 바이오유체소자 개발을 목표로 하였다. 이와 같은 바이오유체소자를 이용한 분석방법은 넓은 범위의 조건을 지닌 다양한 시료에 능동적으로 반응하여 보다 정확한 분석이 가능해 지는 장점을 갖게 된다. 측정에 한정하여 설명하면, 시료의 전 처리 과정시 전자계측기기의 자동이득조절 (automatic gain control)처럼 적절히 유체조작함으로써 시료의 측정 범위가 넓어지고, 정확도가 증대되는 장점이 있다.
분석 방법의 예로써, 흡광도법의 경우 시료에 흡수되는 빛의 양의 변화를 측정하여 시료의 농도를 알 수 있다. 이때 시료의 흡광도 값이 높은 경우는 대부분의 흡광도 측정기가 측정할 수 없는 한계에 놓이기 때문에 정확한 결과를 얻기 위해서는 반드시 흡광도 범위 0.4 - 0.7 에서 분석기기를 사용하여야 한다.
본 연구에서는 계측장비의 최적조건에서 시료농도를 측정하기 위해 바이오유체기술을 이용하여 대표적인 시료 전처리 과정인 희석(dilution)을 칩 상에서 자동화함으로써, 광학 측정 및 시료 전처리에 적합한 바이오유체소자 (bio-fluidic device)를 개발하였다. 자동 희석을 구현하기 위하여, 희석비율을 조절할 수 있는 기술과 “왔다갔다 혼합 (to-and-fro mixing)”을 고안하였다. 여기서 자동희석은 단순히 미리 설정된 비율로 섞어지는 것이 아니라, 특정 설정 값까지 희석하는 기능을 포함한다. 이러한 기능을 갖는 바이오유체소자는 PDMS (polydimethylsiloxane)을 이용한 주조(molding) 방법으로 제작하였고, 실험 장치는 유체를 구동시키기 위한 주사기 펌프, 시료를 통과한 빛의 세기를 측정하는 분광기(spectrophotometer), Visual C++ 제어 프로그램이 동작하는 PC 등으로 구성하였다.
바이오유체소자를 이용한 자동 희석기능을 검증하기 위해 붉은 색소 용액을 이용하여 “왔다갔다 혼합” 과정을 구현하였다. 또한, 이를 이용하여 여러 단계의 희석 및 원하는 목표치까지 희석하는 과정을 자동 수행할 수 있음을 알 수 있었다. 시료 용액의 점도(viscosity) 값이 2.095 cp 이하인 경우 “왔다갔다 혼합” 횟수가 20회 이내로 혼합이 이루어짐을 확인 하였다.
이 같은 결과를 토대로 완성된 바이오유체소자 및 측정시스템을 이용하여 대장균 (E.coli) 시료를 전처리하여 세포 농도를 측정하는 실험을 수행하였다. 일반적으로 세포농도 측정을 위해서는 흡광도 (O.D)를 측정하는 데 흡광도 값이 수십 이상으로 증가하게 되는 고농도 배양 (high-density culture)시에는 일련의 시료희석과정이 반드시 필요하며, 반복되는 희석과정의 번거로움과 희석에 따른 큰 측정오차를 유발하는 단점이 있었다. 기존의 측정 방법과 본 연구의 자동희석 방법을 비교해 볼 때 흡광도 측정시 높은 상관관계를 보여 주었고, 사용한 시료의 부피는 2ml에서 60μl로 줄어들게 되는 장점이 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 바이오유체소자 및 시스템을 이용하여 대장균의 고농도 배양실험을 자동화하는 데도 크게 기여할 수 있음을 확인하였다.
이상의 결과로부터 광학 측정 및 시료 전처리용 바이오유체소자 및 자동희석 방법은 미생물 발효기에서 세포 농도의 자동측정, 수질환경 시료의 전처리 및 수질모니터링 시스템의 개발, 시료전처리 기능이 겸비된 랩온어칩 개발이외에도 시료에 따라 적절히 처리해준다는 본래의 목적을 잘 달성하면서도 제한 조건이 특별히 없어서 다양한 목적을 지닌 바이오유체 시스템에 적용할 수 있을 것으로 기대 된다.
