The post synaptic density (PSD) is a postsynaptic membrane specialization at neuronal synapses. The PSD undergoes dynamic structural changes and protein turnover during synaptic maturation and plasticity. A key mechanism controlling protein turnover is the ubiquitin-proteasome pathway. Here I identified Dorfin, a RING finger-type E3 ubiquitin ligase, as a binding partner of PSD-95, an abundant PSD component that is important for synaptic structure and plasticity. The C terminus of Dorfin interacts with the PDZ domains of PSD-95. Dorfin selectively binds to the PSD-95 family proteins as shown in yeast two-hybrid, coimmunoprecipitation and coclustering assays. Dorfin selectively ubiquitinates PSD-95 and other PSD-95 family proteins. These results suggest that Dorfin, through the degradation of PSD-95 family proteins, contributes to the structural and functional plasticity of synapses.
PSD라고 불리우는 postsynaptic density는 특화된 시냅스 구조물로서 신호 전달과 시냅스 형성, 유지에 중요하며, receptor를 통한 여러 단백질들이 복잡한 network를 이루고 있다. 단단하게 보이는 구조이지만 시냅스 발달 과정 중, 또는 외부 자극에 반응하여 PSD 안의 단백질들은 활발하게 modification되고 생성 및 분해된다. 그 가운데 PSD-95는 지금까지 그 기능이 가장 활발하게 연구된 단백질로서 시냅스 막으로 다른 단백질들의 수송, 시냅스 안정화, 신호 전달 조절 등의 역할을 한다. PSD-95 기능에 관하여 더 알아볼 목적으로 mouse cDNA library를 이용하여 screen을 한 결과 Dorfin이 PSD-95와 상호 작용을 하는 것을 알아내었다. Dorfin은 E3 ubiquitin ligase로서 단백질이 분해될 때 특정한 단백질을 ubiquitin에 전달해 주는 중요한 효소이다. PSD에서 일어나는 단백질의 발현 조절에 관여하는 가장 중요한 세포 기작이 ubiquitin- proteasome pathway이므로 Dorfin에 의한 PSD-95분해는 그 중요도가 상당히 높다.
Dorfin이 PSD-95를 비롯한 PSD-95 family단백질들과도 결합하는 지 알아보기 위해서 Yeast Two-hybrid assay, GST-pull down assay, in vitro coimmunoprecipitation assay를 수행하였다. 그 결과 SAP97, Chapsyn-110, 약한 정도로 SAP102와도 상호 작용하는 것을 알아내었다. 이 상호 작용이 실제 brain에서도 일어나는 지 알아보기 위해 rat brain의 시냅스 구성 부분을 분리하여in vivo coimmunoprecipitation assay를 수행한 결과 PSD-95, Chapsyn-110, SPAR와 상호 작용함을 알아내었다. 또한 COS7 cell에서 Dorfin 과 PSD-95, SAP97은 co-clustering을 형성하는colocalization pattern을 나타내었다.
Dorfin은 단백질이 proteasome을 통하여 분해될 때 특정 단백질에 ubiquitin이 붙도록 도와주는 ubiquitin protein ligase로서, PSD-95를 비롯한 PSD에 존재하는 단백질들을 분해 시키는 지 알아보고자 하였다. HEK cell에서 ubiquitination assay를 수행한 결과 PSD-95와 SAP97, Chapsyn-110, S-SCAM을 분해하였으며, PSD-95 family protein 이외에 PSD에 존재하면서 중요한 기능을 하는 여러 단백질에는 작용하지 않았다. 이 결과로부터 Dorfin은 특이적으로 PSD-95 family 와 상호 작용을 하여 ubiquitination시킨다는 것을 알아내었다.
Dorfin은 발생학적으로 꾸준히 발현되었으며in situ hybridization assay를 통해hippocampus와 cortex에서 발현되는 것을 밝혀내었다. neuron에서 siRNA를 통해 Dorfin 발현이 억제되는 것을 확인하였으며 앞으로의 실험을 통해 Dorfin은 PSD-95와 SAP97을 비롯한 PSD-95 family protein이 분해될 때 필요한 ubiquitin protein ligase로서, 시냅스에서 신호 전달에 중요한 단백질의 turnover와 시냅스의 구조 및 기능 변화를 조절한다는 것을 확증할 것이다.
